鉴定三七成分的环介导等温扩增荧光检测方法、引物、试剂盒及应用技术

本发明专利技术涉及鉴定三七成分的环介导等温扩增荧光检测方法、引物、试剂盒及应用，属于生物检测技术领域。本发明专利技术采用的是核酸体外快速扩增与荧光检测技术融合的新型技术，通过针对目的片段设计6条特异引物，通过增曲线实时监控整个等温扩增核酸复制的反应过程，对产物做溶解曲线分析。本发明专利技术建立鉴定三七成分环介导等温扩增方法，可对待检样本中是否含有三七进行DNA层面的快速定性检测，大大缩减了检测使用时间，实现了三七策成分的快速检测，DNA提取后无需纯化即可上机实验，6条引物对应目标序列8个特异区域的识别保证了检测反应的高度特异性，具有良好的应用前景。

Identification of 37 components by loop mediated isothermal amplification, fluorescence detection, primers, kit and Application

The invention relates to a RING-mediated isothermal amplification fluorescence detection method, a primer, a reagent box and an application for identifying the components of Panax notoginseng, belonging to the technical field of biological detection. The invention adopts a novel technology which combines rapid amplification of nucleic acid in vitro with fluorescence detection technology. Six specific primers are designed for the target fragment, and the whole reaction process of isothermal amplification of nucleic acid replication is monitored in real time by amplification curve, and the dissolution curve of the product is analyzed. The invention establishes a loop-mediated isothermal amplification method for identifying Panax notoginseng components, which can be used for rapid qualitative detection at the DNA level on the sample containing panax notoginseng, greatly reducing the detection time and realizing the rapid detection of Panax notoginseng components. After DNA extraction, it can be carried out on the computer without purification. Six primers correspond to eight specific target sequences. The recognition of different regions ensures the high specificity of the detection reaction and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
鉴定三七成分的环介导等温扩增荧光检测方法、引物、试剂盒及应用
本专利技术属于生物检测
，特别涉及鉴定三七成分的环介导等温扩增荧光检测方法、引物、试剂盒及应用。
技术介绍
三七为我国传统名贵中药材，四十种大宗药材品种之一，距今已有400多年的应用历史，在国内外久负盛名，三七自古就有“止血神药”的美称。由于三七独特明显的功效，越多的百姓开始在日常生活中服用；用它做原料的中成药达360多种，涉及制药企业1350多家；其价格居高不下，价格的波动足以影响到上千家的制药企业。不为人熟知的是，三七市场背后隐藏的乱象，偷偷侵蚀的却是消费者的健康。因为三七价格昂贵，有不少不法分子为了谋取暴利，以假乱真，以次充好，为购买三七的客户带来不便，水三七、藤三七、莪术等因与三七形状或性状类似，都是掺假掺杂的常见目标，另外加工后的三七粉则更容易做手脚。因此，如能建立一种基因水平的快速检测方法，上述问题将迎刃而解。环介岛等温扩增技术（LAMP）是新型分子诊断技术，其反应过程在恒温条件下进行，通过添加有特殊链置换活性的DNA聚合酶和针对目标基因特异性片段设计的引物组使核酸在恒温条件下完成，有快速，灵敏和特异的优点。实时荧光法与LAMP技术相结合的检测方式则使得检测更加准确和直观，核酸复制扩增反应结束后可对产物做退火溶解曲线分析，溶解曲线可进一步坚定该核酸扩增产物是否是特异性扩增。近年来被越来越多的实验者应用到实际检测中，准确、高效、简单、快速、特异，非常适合三七种属快速检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种快速、准确、灵敏、操作简单的鉴定三七成分的环介导等温扩增荧光检测方法、引物及试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：鉴定三七成分的环介导等温扩增引物，包括外部引物对、内部引物对和环引物对；所述的外部引物对的序列为：上游外部引物F3:atacgattagcaatgtcctcc；下游外部引物B3:ccttgttgtgagctggtg；所述的内部引物对的序列为：上游内部引物FIP:cagtgggcggatcaaagtacaacttgtcacggtccttaacc；下游内部引物BIP:aggcataaccagcattggcattgtggatggaactcaacg；所述的环引物对的序列为：上游环引物LF:tgttgtggacgtatggcaa；下游环引物LB:cccaagctcaatgcttcaag。本专利技术提供含有上述扩增引物的鉴定三七成分的试剂盒。进一步，优选的是，所述的试剂盒还包括：阳性对照模板、阴性对照模板和PCR反应液；所述的阳性对照模板为三七的基因组DNA；所述的阴性对照模板为其他植物的基因组DNA。进一步，优选的是，所述的阳性对照模板为三七根部的基因组DNA。进一步，优选的是，所述的阴性对照模板为水三七的基因组DNA或莪术的基因组DNA。进一步，优选的是，所述的试剂盒的扩增体系为：模板4μL，上游外部引物F35uM1μL，下游外部引物B35uM1μL，上游内部引物FIP40uM1μL，下游内部引物BIP40uM1μL，上游环引物LF20uM1μL，下游环引物LB20uM1μL，PCR反应浓缩液15ul，总计25μL。进一步，优选的是，所述的试剂盒的工作程序为：扩增程序：65℃扩增30min；溶解程序：98-80℃，0.05℃为一个循环。本专利技术还提供上述扩增引物在鉴别三七真伪中的应用。本专利技术还同时提供上述试剂盒在鉴别三七真伪中的应用。本专利技术另外提供鉴定三七成分的环介导等温扩增荧光检测方法，采用上述试剂盒或者上述扩增引物，包括如下步骤：步骤（1），使用植物基因组提取试剂盒提取样本DNA；步骤（2），分别以阳性对照模板、阴性对照模板、待检测样本DNA作为模板进行制备如下扩增体系：模板4μL，上游外部引物F35uM1μL，下游外部引物B35uM1μL，上游内部引物FIP40uM1μL，下游内部引物BIP40uM1μL，上游环引物LF20uM1μL，下游环引物LB20uM1μL，PCR反应浓缩液15ul，总计25μL；步骤（3），将上述制备好的扩增体系进行PCR反应；设置扩增程序：65℃扩增30min；溶解程序：98-80℃，0.05℃为一个循环，做扩增曲线和溶解曲线；步骤（4），根据所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定：若扩增曲线有明显的“S”型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，则判定为阳性结果，说明样品中含有三七；扩增曲线没有出现明显“S”型曲线，则判定为阴性结果，说明样品中不含有三七；扩增曲线有明显“S”型曲线，但溶解曲线峰型不单一判定为非特异性扩增，则需重复步骤（1）-步骤（3），之后再次按照上述判定方法进行判定；阳性对照模板的检测结果是阳性结果，阴性对照模板的检测结果是阴性结果，则是说明实验有效，否则实验无效。本专利技术中扩增曲线有明显“S”型曲线，但溶解曲线峰型不单一判定为非特异性扩增，说明结果是假阳性，有可能掺杂了其它物质，所以要重新进行检测。PCR反应浓缩液中含有DNA聚合酶、Buffer、dNTP、MgSO4、Betaine、荧光染料Evagreen。本专利技术采用的是核酸体外快速扩增与荧光检测技术融合的新型技术，通过针对目的片段设计6条特异引物，使用有特殊活性的新型DNA聚合酶（DNABST聚合酶），添加双链结合的荧光染料；通过扩增曲线实时监控整个等温扩增核酸复制的反应过程，对产物做溶解曲线分析；对核酸进行定性或简单定量（半定量）。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：（1）高特异性：6条引物对应目标序列8个特异区域的识别保证了检测反应的高度特异性。（2）本专利技术建立检测三七成分环介导等温扩增方法，可对待检样本中是否含有三七进行DNA层面的快速定性检测；（3）使用本专利技术，核酸提取后无需纯化即可上机实验；（4）使用了环介导等温扩增方法，大大缩减了检测使用时间，实现了三七策成分的快速检测；与传统的方法对比，本专利技术检测只需15到20分钟；而传统的PCR检测至少3小时；（5）简化了检测过程，降低了对操作人员的专业要求。使得非专业人员可以顺利完成检测工作；（6）本专利技术试剂盒可用于多个检测平台上，不仅可以用在等温扩增荧光检测仪和定量PCR仪，也可以用在其他可以提供恒定温度的设备上进行，如金属浴等。附图说明图1为特异性实验得到的扩增曲线；图2为特异性实验得到的扩增曲线。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本专利技术所采用的PCR反应浓缩液购自OptiGeneLtd.，型号为IsothermalMasterMix(IMM)本专利技术所采用的植物基因组提取试剂盒为TIANGEN植物基因组提取试剂盒DP305。步骤（1），使用植物基因组提取试剂盒提取样本DNA；步骤（2），分别以阳性对照模板、阴性对照模板、待检测样本DNA作为模板进行制备如下扩增体系：模板4μL，上游外部引物F35uM1μL，下游外部引物B35uM1μL，上游内部引物FIP40uM1μL，下游本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鉴定三七成分的环介导等温扩增引物，其特征在于，包括外部引物对、内部引物对和环引物对；所述的外部引物对的序列为：上游外部引物F3:atacgattagcaatgtcctcc；下游外部引物B3:ccttgttgtgagctggtg；所述的内部引物对的序列为：上游内部引物FIP:cagtgggcggatcaaagtacaacttgtcacggtccttaacc；下游内部引物BIP:aggcataaccagcattggcattgtggatggaactcaacg；所述的环引物对的序列为：上游环引物LF:tgttgtggacgtatggcaa；下游环引物LB:cccaagctcaatgcttcaag。

【技术特征摘要】
1.鉴定三七成分的环介导等温扩增引物，其特征在于，包括外部引物对、内部引物对和环引物对；所述的外部引物对的序列为：上游外部引物F3:atacgattagcaatgtcctcc；下游外部引物B3:ccttgttgtgagctggtg；所述的内部引物对的序列为：上游内部引物FIP:cagtgggcggatcaaagtacaacttgtcacggtccttaacc；下游内部引物BIP:aggcataaccagcattggcattgtggatggaactcaacg；所述的环引物对的序列为：上游环引物LF:tgttgtggacgtatggcaa；下游环引物LB:cccaagctcaatgcttcaag。2.含有权利要求1所述扩增引物的鉴定三七成分的试剂盒。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括：阳性对照模板、阴性对照模板和PCR反应浓缩液；所述的阳性对照模板为三七的基因组DNA；所述的阴性对照模板为其他植物的基因组DNA。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照模板为三七根部的基因组DNA。5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照模板为水三七的基因组DNA或莪术的基因组DNA。6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其扩增体系为：模板4μL，上游外部引物F35uM1μL，下游外部引物B35uM1μL，上游内部引物FIP40uM1μL，下游内部引物BIP40uM1μL，上游环引物LF20uM1μL，下游环引物LB20uM1μL，PCR反应浓缩液15ul，总计25μL。7.如权利要求3所述的试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢迎春，贾兵，张广辉，陈军文，杨生超，宋婉玲，朱书生，朱有勇，陈中坚，魏富刚，张强皓，韦海南，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南,53