本发明专利技术提供了适用于毛细管电泳检测技术的一组水稻SSR分子标记及其应用，共13个SSR分子标记，并提供一套适于毛细管电泳平台的检测所述SSR分子标记的引物组合。利用这13个SSR分子标记可以：(1)构建水稻品种SSR标记指纹数据库；(2)水稻样本母系溯源分析；(3)水稻品种鉴定及遗传多样性分析；(4)区分水稻品种北稻7和龙粳29品种。通过本发明专利技术的水稻SSR分子标记的应用，能够在基因组水平上拓展了水稻可用标记位点的范围；为水稻品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，细胞质遗传特性等研究提供新工具，应用前景良好。
A set of rice SSR molecular markers suitable for capillary electrophoresis detection and their application
The invention provides a group of rice SSR molecular markers and their applications for capillary electrophoresis detection, 13 SSR molecular markers, and a set of primer combinations for the detection of SSR molecular markers for capillary electrophoresis platforms. The 13 SSR markers could be used as follows: (1) the SSR marker fingerprint database of rice varieties was constructed; (2) the analysis of maternal traceability of rice samples; (3) rice variety identification and genetic diversity analysis; (4) rice variety North rice 7 and dragon japonica 29. The application of the SSR molecular marker of this invention can expand the range of rice marker sites at the genome level, and provide new tools for rice varieties, germplasm resources identification, phylogenetic relationship evaluation, cytoplasmic inheritance and so on.
【技术实现步骤摘要】
适用于毛细管电泳检测技术的一组水稻SSR分子标记及其应用
本专利技术属于农作物分子生物学
，具体地说，涉及适用于毛细管电泳检测技术的一组水稻SSR分子标记及其应用。
技术介绍
水稻是我国最重要的粮食作物之一，其播种面积和总产量均居粮食作物首位。全国约60％的人口以大米为食。我国丰富的稻种资源是稻作研究和生产上的一大优势，经过80多年的育种实践，已培育出5000多份水稻品种并在生产中推广应用。对水稻品种的鉴定、遗传多样性分析及DNA指纹数据库的构建，可以客观、全面了解当前水稻品种现状，对于品种管理、品种选育以及种质资源收集和保护具有重要意义。随着分子生物技术的发展，分子标记种类和检测手段日趋完善，各种分子标记已经广泛应用于水稻遗传多样性研究中。众多分子标记中，简单重复序列(SimpleSequenceRepeats,SSR)标记因具有简便、快捷、重复性高、多态性高、共显性标记等优点而被广泛应用。传统的SSR操作通过聚丙烯酰胺凝胶电泳配合其他一些生物技术来进行基因的多态性分析，这些方法非自动化、耗时，不同等位变异难以准确识别、不同批次反应数据难以统一处理。荧光标记毛细管电泳检测技术因具有高效、自动化的优点，在多种植物分子标记研究中显示出极为广阔的应用前景。该方法采用几种不同颜色的荧光染料标记SSR引物，再将不同荧光标记、扩增片段长度有差异的PCR产物和标准分子量样品在同一泳道中进行电泳。通过图像采集和分析，可精确计算出等位变异扩增片段的大小，实现了SSR标记与高效、自动化技术的结合。在这个技术过程中，如何找出不同荧光标记的引物，并进行组合、且PCR产物长度有差异、能有效准确分辨产物大小，是SSR的关键技术环节。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供适用于毛细管电泳检测技术的一组水稻SSR分子标记。为了实现本专利技术目的，本专利技术通过收集来源广泛、表型和基因型丰富、代表性强的水稻材料，对相应材料的水稻基因组进行测序并比较。本专利技术提供了一组适用于毛细管电泳检测技术的水稻SSR分子标记，所述分子标记为以下13个SSR分子标记的一个或多个，13个SSR分子标记分别为RM3414，RM1347，RM1319，RM215，RM7365，RM1365，RM536，RM235，RM5，RM297，RM515，RM283，RM332。所述13个SSR分子标记分别依次通过以下引物扩增得到：SEQIDNO.1-2，SEQIDNO.3-4，SEQIDNO.5-6，SEQIDNO.7-8，SEQIDNO.9-10，SEQIDNO.11-12，SEQIDNO.13-14，SEQIDNO.15-16，SEQIDNO.17-18，SEQIDNO.19-20，SEQIDNO.21-22，SEQIDNO.23-24，SEQIDNO.25-26。本专利技术提供了用于扩增上述SSR分子标记的特异性引物，其为一下任一对：SEQIDNO.1-2，SEQIDNO.3-4，SEQIDNO.5-6，SEQIDNO.7-8，SEQIDNO.9-10，SEQIDNO.11-12，SEQIDNO.13-14，SEQIDNO.15-16，SEQIDNO.17-18，SEQIDNO.19-20，SEQIDNO.21-22，SEQIDNO.23-24，SEQIDNO.25-26。本专利技术提供了上述水稻SSR分子标记在构建水稻品种DNA指纹数据库中的应用。本专利技术提供了上述水稻SSR分子标记在水稻种质资源遗传多样性分析中的应用。本专利技术提供了上述水稻SSR分子标记在水稻鉴定中的应用。本专利技术提供了上述水稻SSR分子标记在水稻分子标记辅助育种中的应用。本专利技术提供了上述水稻SSR分子标记在制备水稻基因组芯片中的应用。本专利技术提供了含有上述水稻SSR分子标记的水稻基因组芯片。本专利技术提供了上述水稻SSR分子标记在区分水稻北稻7和龙粳29品种中的应用。以上所述的应用，包括以下步骤：1)提取待测水稻样品的DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用上述SSR分子标记，进行PCR扩增；3)采用毛细管电泳系统检测PCR产物。上述应用的步骤2)中，PCR扩增采用20μL的反应体积，含dNTP0.25mM，正向引物、反向引物各0.4μM，TaqDNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液(不含Mg2+)，MgCl21.5mM，样品DNA10-40ng。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。进一步地，本专利技术提供了用于区分水稻北稻7和龙粳29品种的试剂盒，其含有针对本专利技术的13个水稻SSR分子标记的特异性引物组合。优选地，所述特异性引物组合的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-26所示。本专利技术提供的上述13对SSR引物可以在荧光毛细管电泳平台上实现基因分型数据的获得。具体方案为，每对引物的其中一条的5'端标记荧光基团；配制PCR反应体系加入DNA、引物、dNTP、MgCl2、Taq酶、Buffer；运行反应程序；扩增产物在荧光毛细管电泳系统上检测；利用毛细管电泳系统配套软件收集原始数据，导入基因型软件分析原始数据获得片段长度格式的基因型数据。优选地，将本专利技术的13对特异性SSR引物进行荧光染料标记，共选用了PET、NED、VIC、FAM四种荧光染料。将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1μL加入0.5μLLZ500分子量内标和8.5μL去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测。用GeneMapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标LZ500进行比较，直接给出目标DNA片段的准确大小。在本专利技术的实施例的一个较佳实施方案中，FAM荧光标记组的SSR分子标记为RM3414、RM1347、RM1319；VIC荧光标记组的SSR分子标记为RM215、RM7365、RM1365、RM536；NED荧光标记组的SSR分子标记为RM235、RM5、RM297、RM515；PET荧光标记组的SSR分子标记为RM283、RM332。以水稻北稻7DNA为模板，分别用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的四组引物进行四次毛细管电泳，得到四个电泳图结果；再以北稻7的DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的全部引物混合物进行毛细管电泳得到总电泳图结果。将总电泳图结果分别与FAM、VIC、NED、PET四组荧光标记引物电泳的结果进行比较(图1)，可以看到，在FAM、VIC、NED、PET单独电泳图上出现的目的峰均能在总电泳图上分辨出来，且每个颜色的峰互不干扰，即说明本专利技术提供的引物组合(共13对引物)可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果。以水稻龙粳29DNA为模板进行相同的实验，可得到相同的结论(图2)。实施例中分别以北稻7和龙粳29DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合进行一次性毛细管电泳，分别得到北稻7和龙粳29的毛细管电泳图并进行比较本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.适用于毛细管电泳检测技术的水稻SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记为以下13个SSR分子标记的一个或多个，分别为RM3414，RM1347，RM1319，RM215，RM7365，RM1365，RM536，RM235，RM5，RM297，RM515，RM283，RM332。
【技术特征摘要】
1.适用于毛细管电泳检测技术的水稻SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记为以下13个SSR分子标记的一个或多个，分别为RM3414，RM1347，RM1319，RM215，RM7365，RM1365，RM536，RM235，RM5，RM297，RM515，RM283，RM332。2.根据权利要求1所述的水稻SSR分子标记，其特征在于，所述13个SSR分子标记分别依次通过以下引物扩增得到：SEQIDNO.1-2，SEQIDNO.3-4，SEQIDNO.5-6，SEQIDNO.7-8，SEQIDNO.9-10，SEQIDNO.11-12，SEQIDNO.13-14，SEQIDNO.15-16，SEQIDNO.17-18，SEQIDNO.19-20，SEQIDNO.21-22，SEQIDNO.23-24，SEQIDNO.25-26。3.权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：温洪涛，张瑞英，关海涛，张晓磊，黄盈莹，
申请(专利权)人：黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23
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