一种兽用腐败梭菌毒素及其制备方法与专用培养基技术

本发明专利技术公开了一种兽用腐败梭菌毒素及其制备方法与专用培养基。每100ml培养基由下述物质组成：示蛋白胨(proteose peptone)1.5‑2.0g，酪蛋白胨1.5‑2.0g，酵母浸粉0.5‑0.75g，ZnSO4·7H2O 0.14‑0.28mg，Na2HPO4·12H2O 0.5‑0.75g，KH2PO40.03‑0.045g，葡萄糖1‑1.5g，余量为水；所述培养基的pH值为7.5‑8.0。所述腐败梭菌毒素是将腐败梭菌生产菌株接种于培养基中，收集培养物并离心，将上清液过滤即得。按本发明专利技术方法毒力最高可提至《中国兽用生物制品规程》制苗标准的10倍，产出投入比可提高至原传统工艺的20倍。并且，用其制备的类毒素疫苗在家兔和绵羊上的相应血清中和效价也分别提高至规程标准的8和8倍。

Veterinary Clostridium toxin and its preparation method and special culture medium

The invention discloses a veterinary Clostridium toxin, a preparation method and a special culture medium. Each 100ml medium consists of the following substances: proteose peptone 1.5 2.0g, casein peptone, 2.0g, yeast extract 0.5 0.75g, ZnSO4. 7H2O 0.14 0.28mg, Na2HPO4. 12H2O 0.5 0.75g, 1 glucose and water; the value of the culture medium is 7.5 8. The toxin of Clostridium putrefaciens inoculates the production strain of Clostridium putrefaciens in the culture medium, collects the culture material and centrifuges, and filters the supernatant. The maximum toxicity of this method can be raised to 10 times as much as the standard for Chinese veterinary biologics, and the output input ratio can be increased to 20 times as much as the original traditional process. In addition, the neutralization titer of the toxoid vaccine prepared with the vaccine in the serum of rabbits and sheep was also increased to 8 and 8 times as much as the standard.

【技术实现步骤摘要】
一种兽用腐败梭菌毒素及其制备方法与专用培养基
本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及一种兽用腐败梭菌毒素及其制备方法与专用培养基。
技术介绍
羊快疫、猝狙、羔羊痢疾和肠毒血症是分别由腐败梭菌、C型产气荚膜梭菌、B型产气荚膜梭菌和腐败梭菌引起的羊常见多发性传染病(陆承平.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社,2013:192-202.)，它们常常合并发生，病程急剧，发病动物常常不出现症状即行死亡，死亡率高，危害大。因此，免疫接种是控制这些疫病的唯一有效途径。欧美、澳大利亚等畜牧业发达国家均把牛羊的四种疫病作为必须免疫预防的疫病，并有多种含有预防这些疫病成分的疫苗投放市场(AnimalandPlantHealthInspectionService,USDA.9CFRCh.I(1-1-07Edition)[S].Washington:U.S.GOVERNMENTPRINTINGOFFICE,2007.3、BritishPharmacopoeia(Veterinary)[S].London:TheStationeryOffice,2005.)。我国也采取免疫接种的方法预防这些疫病并取得了良好的效果。我国目前用于预防这些疫病的疫苗有羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗(液体苗)、羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗(液体苗)和羊梭菌病多联干粉疫苗(干粉苗)(中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部[S].北京：中国农业出版社,2011.5、农业部兽用生物制品规程委员会编.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○版[S].北京：化学工业出版社,2000.)，预防效果确实。据2015年批签发统计，年产量达2.5亿头份，但实际需要远大于此。年产值约2500万元到3000万元。然而，目前市场上使用的疫苗普遍以牛肉和肝脏的酶消化液为原材料来制备培养基，用这种方法制备培养基其制备过程繁琐、耗时长、需要人力多，尤为重要的是常因原材料质量参差不齐出现产毒性能不稳定的现象，这影响了疫苗的质量，也给疫苗生产带来了极大的浪费和高额的成本。并且，在2006年到2015年之间以血清中和法进行效力检验结果不合格的33批产品中，有15批产品的腐败梭菌组分效价不合格。因此，研发出质量可靠、产毒力高、稳定性好的腐败梭菌毒素制备方法与专用培养基显得尤为必要。
技术实现思路
本专利技术一个目的是提供一种腐败梭菌产毒培养基。本专利技术提供的培养基，包括溶质；所述溶质由如下质量分数的物质组成：1.5-2.0示蛋白胨、1.5-2.0酪蛋白胨、0.5-0.75酵母浸粉、0.00014-0.00028ZnSO4·7H2O、0.5-0.75Na2HPO4·12H2O、0.03-0.045KH2PO4和1-1.5葡萄糖。上述培养基中，所述溶质由如下质量分数的物质组成：1.5-2.0示蛋白胨、1.5-2.0酪蛋白胨、0.5-0.75酵母浸粉、0.00014-0.00028ZnSO4·7H2O、0.5-0.75Na2HPO4·12H2O、0.03-0.045KH2PO4和1葡萄糖。上述培养基中，所述溶质由如下质量分数的物质组成：1.5示蛋白胨、1.5酪蛋白胨、0.5酵母浸粉、0.00014ZnSO4·7H2O、0.5Na2HPO4·12H2O、0.03KH2PO4和1葡萄糖。上述培养基中，所述培养基还包括溶剂；或所述溶剂为水。上述培养基中，所述培养基由示蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、ZnSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、葡萄糖和水组成；所述示蛋白胨在所述培养基中的浓度为15-20g/l；所述酪蛋白胨在所述培养基中的浓度为15-20g/l；所述酵母浸粉在所述培养基中的浓度为5-7.5g/l；所述ZnSO4·7H2O在所述培养基中的浓度为0.0014-0.0028g/l；所述Na2HPO4·12H2O在所述培养基中的浓度为5-7.5g/l；所述KH2PO4在所述培养基中的浓度为0.3-0.45g/l；所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为10-15g/l；或，所述示蛋白胨在所述培养基中的浓度为15g/l；所述酪蛋白胨在所述培养基中的浓度为15g/l；所述酵母浸粉在所述培养基中的浓度为5g/l；所述ZnSO4·7H2O在所述培养基中的浓度为0.0014g/l；所述Na2HPO4·12H2O在所述培养基中的浓度为5g/l；所述KH2PO4在所述培养基中的浓度为0.3g/l；所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为10g/l；或，所述培养基的pH值为7.5-8.0。本专利技术的另一个目的是提供一种制备上述的培养基的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：将上述的培养基中除葡萄糖外其余各组分按照质量分数与水混匀，并调节pH值至7.5-8.0，灭菌后，再将葡萄糖单独配制成50％水溶液灭菌，使用前加入至所需浓度，得到培养基。上述方法中，在溶解溶质的过程中，可通过加热的方式使物质充分溶解和/或加速溶解。上述方法中，所述调节pH值具体可采用10M的氢氧化钠溶液进行调节。上述方法中，所述培养基灭菌的条件为116℃灭菌30min，50％葡萄糖溶液灭菌的条件为112℃灭菌20min。上述方法中，所述水优选为纯化水。上述的培养基在制备腐败梭菌毒素中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的第3个目的是提供一种制备腐败梭菌毒素的方法。本专利技术提供的方法，为将腐败梭菌生产菌株在上述的培养基中发酵培养，得到发酵产物；收集发酵产物的上清液，得到腐败梭菌毒素。腐败梭菌生产菌株具体可为兽用腐败梭菌C55-1菌株(CVCC编号：60021)，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(www.cvcc.org.cn，简称CVCC)。收集发酵产物的上清液为离心后再过滤得到上清液。上述方法中，所述发酵培养的条件为如下：1)若所述发酵培养为烧瓶(如装有培养基体积为500-1000ml的容器)发酵，则所述发酵培养的条件为：35-37℃发酵培养23-25h；2)若所述发酵培养为发酵罐(如装有培养基体积为大于或等于4000ml的容器)发酵，则所述发酵培养的条件为：35-37℃发酵培养23-25h，且发酵过程中维持pH值为7.0±0.05，且发酵培养至16h时按培养基总体积的1％加入50％葡萄糖水溶液；发酵全程控制转速为25-30rpm。上述方法中，将腐败梭菌生产菌株在上述的培养基中发酵培养包括如下步骤：1)获得种子液；2)再将种子液接种于上述的培养基。所述种子液的接种量为2-3％。所述种子液的制备方法为：将真空度良好的含有冻干菌种的安瓿，无菌操作打开，接种厌气肉肝汤，置37℃培养17-24小时，经纯粹检验合格者作为一级种子。将一级种子按2-3％接种量接种厌气肉肝汤，置37℃培养17-24小时，经纯粹检验合格者作为二级种子，即为所述种子液。由上述方法制备得到的腐败梭菌毒素。上述的腐败梭菌毒素在制备腐败梭菌类毒素疫苗中的应用也是本专利技术保护的范围。上述腐败梭菌类毒素疫苗具体选自下述至少一种：(1)羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗；(2)羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗；(3)羊梭菌病多联干粉灭活疫苗、(4)羊黑疫、快疫二联灭活疫苗。或本专利技术提供一种腐败梭菌类毒素疫苗，是将上述的腐败梭菌毒素经本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腐败梭菌产毒培养基，包括溶质；所述溶质由如下质量分数的物质组成：1.5‑2.0 示蛋白胨、1.5‑2.0 酪蛋白胨、0.5‑0.75 酵母浸粉、0.00014‑0.00028 ZnSO4·7H2O、0.5‑0.75 Na2HPO4·12H2O、0.03‑0.045 KH2PO4和1‑1.5葡萄糖。

【技术特征摘要】
1.一种腐败梭菌产毒培养基，包括溶质；所述溶质由如下质量分数的物质组成：1.5-2.0示蛋白胨、1.5-2.0酪蛋白胨、0.5-0.75酵母浸粉、0.00014-0.00028ZnSO4·7H2O、0.5-0.75Na2HPO4·12H2O、0.03-0.045KH2PO4和1-1.5葡萄糖。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述溶质由如下质量分数的物质组成：1.5-2.0示蛋白胨、1.5-2.0酪蛋白胨、0.5-0.75酵母浸粉、0.00014-0.00028ZnSO4·7H2O、0.5-0.75Na2HPO4·12H2O、0.03-0.045KH2PO4和1葡萄糖。3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述溶质由如下质量分数的物质组成：1.5示蛋白胨、1.5酪蛋白胨、0.5酵母浸粉、0.00014ZnSO4·7H2O、0.5Na2HPO4·12H2O、0.03KH2PO4和1葡萄糖。4.根据权利要求1-3中任一所述的培养基，其特征在于：所述培养基还包括溶剂；或所述溶剂为水。5.根据权利要求1-4中任一所述的培养基，其特征在于：所述培养基由示蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、ZnSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、葡萄糖和水组成；所述示蛋白胨在所述培养基中的浓度为15-20g/l；所述酪蛋白胨在所述培养基中的浓度为15-20g/l；所述酵母浸粉在所述培养基中的浓度为5-7.5g/l；所述ZnSO4·7H2O在所述培养基中的浓度为0.0014-0.0028g/l；所述Na2HPO4·12H2O在所述培养基中的浓度为5-7.5g/l；所述KH2PO4在所述培养基中的浓度为0.3-0.45g/l；所述葡萄糖在所述培养基中的浓度为10-15g/l；或，所述示蛋白胨在所述培养基中的浓度为15g/l；所述酪蛋白胨在所述培养基中的浓度为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋玉文，彭小兵，李旭妮，彭国瑞，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11