利用体细胞克隆技术制备基因敲除犬的方法技术

本发明专利技术涉及利用体细胞克隆技术制备基因敲除犬的方法，尤其是涉及采用低渗透压融合液连同自体胚胎移植的体细胞克隆技术制备基因敲除犬的方法。

【技术实现步骤摘要】
利用体细胞克隆技术制备基因敲除犬的方法
本专利技术涉及利用体细胞克隆技术制备基因敲除犬的方法，尤其是涉及采用低渗透压融合液连同自体胚胎移植的体细胞克隆技术制备基因编辑犬的方法。
技术介绍
犬是目前基础医学研究和教学中最常用的实验动物之一，尤其在生理、药理和病理生理学等实验研究中起着重要作用。通过对犬进行全基因组测序分析，共计确定约1.93万个基因，其中约1.8万个基因与人类已知基因相同，其基因组与人类的相似度高于小鼠等其他实验动物。犬在遗传性疾病方面与人类也极为相似，约有癌症、心脏病、聋哑、失明和免疫性神经系统疾病等360多种遗传疾病与人类相同，适于作为人类疾病研究的模式动物。而且，犬的遗传性疾病少，实验重复性好，血液循环和神经系统发达，消化系统及内脏与人相似，在毒理方面的反应与人类比较接近，尤其适合药理、循环生理、眼科、毒理、外科学等的研究。另外犬性格温顺容易调教，经短期训练能很好地配合实验，被国际医学、生物学界公认为较理想的实验用犬。目前常用的制备犬疾病模型的方法主要包括：饲喂法、机械损伤法及免疫学方法等。由于饲喂法、机械损伤法和免疫学法均是在健康动物基础上，采用特殊的方法诱导其出现疾病表型，因此存在无法出现疾病表型、表型持续时间较短或无法模拟人类疾病症状等问题。而采用基因工程的方法对犬基因组进行基因敲除或转基因修饰，其疾病症状为原发症状，表型持续时间长，并且具有可遗传性。动物体细胞克隆技术是将细胞通过核移植，转移至受体卵母细胞内，生产与供体细胞具有相同DNA序列信息的动物个体。该技术的最大特点是，所出生的克隆动物具有与供体细胞完全一致的遗传信息。因此采用克隆技术可以复制动物体细胞，克隆技术可应用于转基因动物生产、优良家畜扩繁、濒危动物资源保存、进行治疗性克隆等。但是，由于犬繁殖生理与其他哺乳动物有很大区别，造成对犬卵母细胞及胚胎进行体外操作的难度极大，基因敲除或者转基因修饰模型犬以及体细胞克隆犬的建立通常被认为是难以成功。概括来说，在现有制备基因敲除犬的技术中：(1)通常利用犬正常受精胚胎进行胞质注射，这样的技术的缺点是由于犬受精胚胎处于发育期，注射后的受精胚胎在分裂过程中容易造成不同卵裂球的基因敲除类型不一致，即有可能获得基因敲除犬的嵌合体；(2)还没有利用基因打靶技术获得基因敲除犬并且对基因敲除犬进行体细胞克隆从而获得基因敲除效率100％的稳定的基因敲除的克隆犬；以及(3)常常选择同期发情的母犬进行异体胚胎移植，成功率较低，造成克隆犬生产成本的增加，而且，异体胚胎移植所需要的发情母犬数量较多，操作手段复杂，难以实现实际产业化生产克隆犬的目标。因此，需要开发提高犬克隆效率的有效方法，同时也需要开发对本身难以获得的基因敲除犬的基因敲除性状得以全部保留的体细胞克隆犬的方法。
技术实现思路
本专利技术对经受精胚胎胞质注射制备的基因敲除犬进行体细胞克隆，获得了基因敲除体细胞克隆犬，采用了低渗透压的融合液，提高了胚胎的融合效率；而且胚胎移植受体犬只冲取单侧输卵管中的卵母细胞，与其他供体犬获得的克隆胚胎共同移植入未冲卵的另一侧输卵管中，实现自体/异体相结合的胚胎移植，提高了克隆犬的怀孕效率。而且，本专利技术可以采用任何经鉴定为基因敲除的体细胞，也就是任何目标基因完全沉默的体细胞进行克隆，获得了基因敲除效率高达100％，基因敲除效果稳定，不存在任何嵌合体的基因敲除犬。第一方面，本专利技术提供了基因敲除犬的体细胞克隆方法，所述方法包括如下步骤：(1)制备目标基因敲除的体细胞作为核供体；(2)从受体母犬制备去核卵母细胞；(3)将基因敲除体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中，构建克隆胚胎；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母犬；其特征在于：去核卵母细胞获自只单侧冲卵的受体母犬冲卵的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵的那侧输卵管中。在步骤(2)从受体母犬制备去核卵母细胞中，需要先鉴定进入发情期的母犬，具体而言，每天抽血检测阴道涂片、孕酮、促卵胞素及黄体生成素，当角化细胞比例达到80-90％以上，孕酮水平达到4-7ng/mL左右时，认定母犬处于排卵期。在排卵后72h-120h，进行单侧冲卵获得成熟的卵母细胞，然后进行成熟卵母细胞的去核处理。所述基因敲除的体细胞可以是采用基因敲除技术对犬受精卵内源基因进行敲除获得的基因敲除犬的体细胞，所述体细胞是经鉴定目标基因完全沉默的基因敲除体细胞。所述基因敲除的体细胞可以是采用基因敲除技术对犬体细胞内源基因进行敲除，并选择经鉴定目标基因完全沉默的基因敲除体细胞。所述基因敲除的体细胞可以是采用基因敲除技术对犬受精卵内源基因进行敲除获得的基因敲除犬的体细胞，所述基因敲除犬可以是嵌合体，但是所述基因敲除的体细胞是经鉴定目标基因完全沉默的基因敲除体细胞。优选地，所述的目标基因敲除的基因敲除技术可以是规律成簇间隔短回文重复序列技术(CRISPR/Cas9)，锌指核酸酶技术(ZFN)，转录激活因子效应物核酸酶技术(TALENs)和同源重组技术，或与之相近的任意基因敲除技术。优选地，在上述步骤(3)中采用电融合将基因敲除体细胞导入去核卵母细胞的胞质中，并且电融合中使用渗透压为200mOSM-280mOSM的融合液。优选地，在上述步骤(3)的电融合中采用电融合将基因敲除体细胞导入去核卵母细胞的胞质中，并且电融合中使用渗透压为240mOSM的融合液。所述融合液的组成如下：0.20-0.28M甘露醇，0.1mMMgSO4，0.5mMHepes和0.05％BSA。优选地，所述融合液的组成如下：0.24M甘露醇，0.1mMMgSO4，0.5mMHepes和0.05％BSA。优选地，电融合采用2-4kv/cm的电压。也可以采用胞质内注射的方法将基因敲除体细胞导入去核卵母细胞的胞质中，胞质内注射一般用Piezo微注射系统，直接把整个供体细胞或供体细胞核注入胞质内，胞质内注射的方法不需要进行电融合。第二方面，本专利技术提供了APOE基因敲除的体细胞克隆方法，所述方法包括如下步骤：(1)制备APOE基因敲除的体细胞作为核供体；(2)从受体母犬制备去核卵母细胞；(3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中，构建重构胚；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母犬；其特征在于：所述APOE基因敲除的体细胞的APOE基因Exon3包含如下的突变序列：cctggaccagggaggct(SEQIDNO：1)去核卵母细胞获自只单侧冲卵的受体母犬冲卵的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵的那侧输卵管中。优选地，所述APOE基因敲除的体细胞的APOE基因Exon3包含如下的突变序列：ctggagcgcgagctggagccgaaggtccagcaggagccctggaccagggaggctctgggaggc(SEQIDNO：2)。优选地，所述APOE基因敲除的体细胞的APOE基因Exon3的序列如下：gatgctgggccgatgtgcagccggagccggagctggagcgcgagctggagccgaaggtccagcaggagccctggaccagggaggctctgggaggcggcgctggcccgcttctgggattacctg本文档来自技高网...

【技术保护点】
基因敲除犬的体细胞克隆方法，所述方法包括如下步骤：(1)制备目标基因敲除的体细胞作为核供体；(2)从受体母犬制备去核卵母细胞；(3)将基因敲除体细胞导入去核卵母细胞的胞质中，构建克隆胚胎；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母犬；其特征在于：去核卵母细胞获自只单侧冲卵的受体母犬冲卵的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵的那侧输卵管中。

【技术特征摘要】
1.基因敲除犬的体细胞克隆方法，所述方法包括如下步骤：(1)制备目标基因敲除的体细胞作为核供体；(2)从受体母犬制备去核卵母细胞；(3)将基因敲除体细胞导入去核卵母细胞的胞质中，构建克隆胚胎；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母犬；其特征在于：去核卵母细胞获自只单侧冲卵的受体母犬冲卵的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵的那侧输卵管中。2.根据权利要求1的方法，在步骤(2)从受体母犬制备去核卵母细胞中，鉴定角化细胞比例达到80-90％以上，孕酮水平达到4-7ng/mL左右的母犬作为处于排卵期的母犬以用作受体母犬。3.根据权利要求2的方法，在排卵后72h-120h，进行单侧冲卵获得成熟的卵母细胞，然后进行成熟卵母细胞的去核处理。4.根据权利要求1或3的方法，所述目标基因敲除的体细胞是采用基因敲除技术对犬受精卵内源基因进行敲除获得的基因敲除犬的体细胞，所述体细胞是经鉴定目标基因完全沉默的基因敲除体细胞。5.根据权利要求1或3的方法，所述目标基因敲除的体细胞是采用基因敲除技术对犬体细胞内源基因进行敲除，并选择经鉴定为目标基因完全沉默的基因敲除体细胞。6.根据权利要求1或3的方法，所述的目标基因敲除的基因敲除技术选自：规律成簇间隔短回文重复序列技术(CRISPR/Cas9)，锌指核酸酶技术(ZFN)，转录激活因子效应物核酸酶技术(TALENs)和同源重组技术。7.根据权利要求1-6任一项的方法，在所述步骤(3)中采用电融合将基因敲除体细胞导入去核卵母细胞的胞质中，并且电融合中使用渗透压为200mOSM-280mOSM的融合液。8.根据权利要求1-6任一项的方法，在所述步骤(3)中采用电融合将基因敲除体细胞导入去核卵母细胞的胞质中，并且电融合中使用渗透压为240mOSM的融合液。9.根据权利要求7的方法，所述融合液的组成如下：0.2-0.28M甘露醇，0.1mMMgSO4，0.5mMHepes和0.05％BSA。10.根据权利要求1-9任一项的方法，在所述步骤(3)中采用电融合将基因敲除体细胞导入去核卵母细胞的胞质中，并且电融合中使用2-4kv/cm的电压。11.根据权利要求1-10任一项的方法，所述体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。12.根据权利要求11的方法，所述体细胞选自：胎儿成纤维细胞、皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞和成骨细胞。13.APOE基因敲除的体细胞克隆方法，所述方法包括如下步骤：(1)制备APOE基因敲除的体细胞作为核供体；(2)从受体母犬制备去核卵母细胞；(3)将基因敲除体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中，构建克隆胚胎；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母犬；其特征在于：所述APOE基因敲除的体细胞的APOE基因Exon3包含如下的序列：cctggaccagggaggct(SEQIDNO：1)；去核卵母细胞获自只单侧冲卵的受体母犬冲卵的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵的那侧输卵管中。14.根据权利要求13的方法，所述APOE基因敲除的体细胞的APOE基因Exon3包含如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑敏，米继东，赵建平，
申请(专利权)人：北京希诺谷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11