一种小鼠体细胞核移植方法技术

本发明专利技术公开了一种优化的小鼠体细胞核移植方法，利用卵丘细胞、胎儿成纤维细胞和胚胎干细胞这3种细胞构建了重构胚，并比较了这3种重构胚在不同激活液中的激活效率，在不同溶液中的发育效率，采用不同胚胎移植方法的妊娠效率；得出，无钙KSOM激活液是通用的高效激活液，激活效率在93.5％左右；KSOM‑AA培养液适合于卵丘和胚胎干细胞重构胚的体外培养，胎儿成纤维重构胚的最佳培养液为αMEM培养液；当重构胚体外发育至2‑细胞时期，经输卵管双侧移植，每侧移植15枚胚胎可高效获得核移植动物；本发明专利技术的方法能提高重构胚卵裂率和囊胚发育率、克隆动物出生率和成活率，继而提高从重构囊胚中获得胚胎干细胞的成功率。

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠体细胞核移植方法
本专利技术涉及生物
，具体是一种小鼠体细胞核移植方法。
技术介绍
体细胞核移植是指将体细胞核注入到去核的卵母细胞质中获得重构胚，由重构胚最终发育为后代的技术，细胞的重编程能够通过核移植、细胞融合、特定转录因子以及培养条件诱导等方法来实现；但是目前唯一能够诱导细胞重新发育成个体的重编程方法只有体细胞核移植，其他方法只能够在细胞、分子或者生化的水平上产生诱导，并且都存在一些不足之处；但是，自从体细胞核移植技术建立以来，克隆效率一直处于较低的水平，只有很少的重构胚胎能够发育到足月出生，在小鼠中通常只有1～2％的出生率，而且大多数克隆小鼠在出生后不久就会死亡，成功出生的克隆小鼠也会出现胎盘巨大、胎儿过度生长等异常症状，即所谓的“胎儿巨大症”，造成这一现象的主要原因是供体细胞核不能够被完全的重编程所致；重编程主要指的是表观遗传修饰的擦除与重建，主要包括DNA的甲基化、组蛋白的乙酰化、基因组印记的重建、X染色体的复活与失活以及端粒长度的再延伸等修饰的动态变化。小鼠体细胞核移植主要为以下几个步骤：(1)核供体细胞的准备；(2)受体卵母细胞的准备；(3)受体卵母细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠体细胞核移植方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选择实验动物：选用B6D2F1雌雄小鼠提供稳定的卵母细胞；2)配制细胞培养液：2.1)饲养层细胞培养液：500mL，组成成分为：DMEM培养液445mL、牛血清e)50mL、L‑谷氨酰胺5mL；2.2)胚胎干细胞养出培养液：100mL，组成成分为：DMEM培养液80mL、血清替代物15mL、青链霉素混合液1ml、L‑谷氨酰胺1ml、非必须氨基酸1ml、胚胎干细胞核苷酸1ml、β巯基乙醇100μl、白血病抑制因子10μl；2.3)冻存液：500mL，组成成分为：DMEM培养液350mL、血清50mL、L‑谷氨酰胺100mL；配完后10mL分...

【技术特征摘要】
1.一种小鼠体细胞核移植方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选择实验动物：选用B6D2F1雌雄小鼠提供稳定的卵母细胞；2)配制细胞培养液：2.1)饲养层细胞培养液：500mL，组成成分为：DMEM培养液445mL、牛血清e)50mL、L-谷氨酰胺5mL；2.2)胚胎干细胞养出培养液：100mL，组成成分为：DMEM培养液80mL、血清替代物15mL、青链霉素混合液1ml、L-谷氨酰胺1ml、非必须氨基酸1ml、胚胎干细胞核苷酸1ml、β巯基乙醇100μl、白血病抑制因子10μl；2.3)冻存液：500mL，组成成分为：DMEM培养液350mL、血清50mL、L-谷氨酰胺100mL；配完后10mL分装，-20℃保存，有效期12个月，用于细胞的冻存；2.4)丝裂霉素C：100X丝裂霉素C的配置与储存均在生物安全柜中进行，用2mL注射器吸取2mL的血清注入2mg丝裂霉素C棕色药瓶中，充分颠倒混匀后配置成1mg/mL浓储液，开瓶盖，将溶解后的丝裂霉素C分装，存于-20℃中，丝裂霉素C的工作浓度为10μg/mL。3)配制胚胎培养液：3.1)浓缩液：3.1.1)HCZB浓储液：500mL；组成成分为：超纯水495ml、氯化钠2380mg、氯化钾180mg、7水硫酸镁145mg、乙二胺四乙酸二钠20mg、乳酸钠2.65mL、葡萄糖500mg、磷酸二氢钾80mg；3.1.2)10ml氯化钙100X浓储液：由0.2g二水氯化钙和10ml超纯水配制而成；3.1.3)10ml氯化锶100X浓储液：由2.666g六水氯化锶和10ml超纯水配制而成；3.1.4)20ml谷氨酰胺100X浓储液：由0.294g谷氨酰胺和20ml无钙CZB溶液配制而成；3.1.5)细胞松弛素B溶液：由细胞松弛素B以1mg/ml的配比溶于二甲基亚砜溶液中制备而成；3.1.6)聚乙烯吡咯烷酮溶液：质量分数为10％的PVP溶液：由1gPVP和10mlHCZB配制而成；质量分数为3％的PVP溶液：由0.3gPVP和10mlHCZB配制而成；3.1.7)透明质酸酶10X浓储液：由20mlM2培养液和100mg透明质酸酶配制而成；3.2)HCZB胚胎操作液：100ml，pH＝7.4；组成：步骤3.1.1)中制备的HCZB浓储液99ml；碳酸氢钠211mg、步骤3.1.2)中制备的二水氯化钙100X浓储液1ml、丙酮酸钠3mg、谷氨酰胺1ml、牛血清白蛋白500mg；3.3)无钙CZB溶液：组成：步骤3.1.1)中制备的HCZB浓储液100ml、碳酸氢钠211mg、丙酮酸钠3mg、谷氨酰胺1ml、牛血清白蛋白500mg；3.4)M2胚胎操作液3.4.1)M2、M16浓储液浓储液A(10×)200mL；组成：氯化钠11.068g、氯化钾0.712g、磷酸二氢钾0.324g、7水硫酸镁0.586g、乳酸钠8.698g、葡萄糖2g、青霉素0.12g、链霉素0.1g；浓储液B(10×)20mL；组成：碳酸氢钠0.4202g、酚红0.002g；浓储液C(100×)10mL；组成：丙酮酸钠0.036g；浓储液D(100×)50mL；组成：二水氯化钙1.26g；浓储液E(100×)250ml；组成：4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸14.895g、酚红0.025g。3.4.2)从浓储液配制M2培养液M2培养液体积10mL：浓储液A(10×)1.00mL、浓储液B(10×)0.16mL、浓储液C(100×)0.10mL、浓储液D(100×)0.10mL、浓储液E(100×)0.84mL、无酶水7.80mL、牛血清白蛋白40mg；M2培养液体积50mL：浓储液A(10×)5.00mL、浓储液B(10×)0.80mL、浓储液C(100×)0.50mL、浓储液D(100×)0.50mL、浓储液E(100×)4.20mL、无酶水39.0mL、牛血清白蛋白200mg；M2培养液体积100mL：浓储液A(10×)10.0mL、浓储液B(10×)1.60mL、浓储液C(100×)1.00mL、浓储液D(100×)1.00mL、浓储液E(100×)8.40mL、无酶水78.0mL、牛血清白蛋白400mg；M2培养液体积200mL：浓储液A(10×)20.0mL、浓储液B(10×)3.20mL、浓储液C(100×)2.00mL、浓储液D(100×)2.00mL、浓储液E(100×)16.80mL、无酶水156.0mL、牛血清白蛋白800mg；3.4.3)从浓储液配制M16培养液M6培养液体积10mL：浓储液A(10×)1.00mL、浓储液B(10×)1.00mL、浓储液C(100×)0.10mL、浓储液D(100×)0.10mL、无酶水7.80mL、牛血清白蛋白40mg；M6培养液体积50mL：浓储液A(10×)5.00mL、浓储液B(10×)5.00mL、浓储液C(100×)0.50mL、浓储液D(100×)0.50mL、无酶水39.0mL、牛血清白蛋白200mg；M6培养液体积100mL：浓储液A(10×)10.00mL、浓储液B(10×)10.00mL、浓储液C(100×)1.0mL、浓储液D(100×)1.0mL、无酶水78.0mL、牛血清白蛋白400mg；M6培养液体积200mL：浓储液A(10×)20.00mL、浓储液B(10×)20.00mL、浓储液C(100×)2.0mL、浓储液D(100×)2.0mL、无酶水156.0mL、牛血清白蛋白800mg；3.5)配制KSOM-AA胚胎培养液每100mLKSOM-AA胚胎培养液中含乙二胺四乙酸二钠盐0.38mg、氯化钠559.5mg、氯化钾18.5mg、磷酸二氢钾4.75mg、7水硫酸镁4.95mg、乳酸钠盐溶液0.174ml、葡萄糖3.60mg、碳酸氢钠210.0mg、谷氨酰胺14.5mg、丙酮酸钠2.2mg、青霉素6.3mg、链霉素5.0mg；必需氨基酸1.0ml、非必需氨基酸0.5ml；其中乙二胺四乙酸二钠盐优先滴加，将100mg牛血清白蛋白添加到100mLKSOM-AA胚胎培养液中，轻轻混匀使牛血清白蛋白缓慢溶解，不要剧烈摇动液体以避免产生泡沫而导致蛋白质变性；用0.22μm的针头式滤器过滤培养液到无菌的塑料管内，溶液保存在4℃，保存时间1～2周；4)实验器材：4.1)核移植实验器材：Corning塑料培养皿、充油型注射仪、带有Nomarski或Hoffman光学系统的倒置显微镜、锻针仪、压电陶瓷系统、拉针仪、显微操作用针、水银；4.2)细胞培养实验器材：1.5ml、0.6ml和0.2ml离心管；细胞培养皿、离心管、冻存管；细胞培养用移液管；离心机；体式镜；培养箱；生物安全柜；5)实验方法：5.1)准备供...

【专利技术属性】
技术研发人员：李光鹏，杨磊，刘雪霏，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15