双靶生物传感器细胞试验制造技术

本发明专利技术公开了一种不用标记的多重筛选方法，涉及含有表面固定了活细胞的生物传感器，所述活细胞至少有两种靶标，或涉及表面共同固定了含两种类型细胞的混合细胞群的生物传感器，或涉及表面共同固定了混合细胞群的生物传感器，所述混合细胞群包含表达第一种靶标的第一类细胞和表达第二种靶标的第二类细胞，这两类细胞共同固定在所述生物传感器的表面上。所述靶标可以是Ｇｉ－偶联受体、Ｇ１２／１３－偶联受体、受体酪氨酸激酶、离子通道、钠－质子交换蛋白、整联蛋白受体或转运蛋白。不同类别的ＧＰＣＲ大多能独立地介导信号转导，强烈提示信号转导级联反应的空间时间腔室化是ＧＰＣＲ信号转导的关键。受体信号转导下游发生的大多数细胞反应是“开通”或“传送”。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双靶生物传感器细胞试验胃鮮射是棚_封_青_&本申请要求2008年3月5日提交的美国临时申请序列号61/068，266的权益。该 文件的内容和本文述及的出版物、专利及专利文件的全部内容通过引用纳入本文。背景本专利技术涉及，例如用于化合物筛选和化合物模式分析的细胞试验所用的生物传感 器，例如共振波导光栅(RWG)生物传感器和电阻抗生物传感器。概述本专利技术提供用于化合物筛选和化合物模式分析，例如针对一种细胞类型中的两种 不同细胞靶标，或针对不同细胞类型的两种不同细胞靶标的细胞试验所用的方法和装置。附图简述附图说明图1A-1B显示在本专利技术的各实施方式中，分别采用RWG生物传感器和电子生物传 感器进行双重或双靶标特异性筛选的生物传感器细胞试验各方面的内容。图2A-2D显示在本专利技术的各实施方式中，针对两类G蛋白偶联受体(GPCR)的示范 性RWG生物传感器细胞试验。图3A-3C显示在本专利技术的各实施方式中，针对两类G蛋白偶联受体的另一示范性 RWG生物传感器细胞试验。图4显示在本专利技术的各实施方式中，采用RWG生物传感器的示范性双重和靶标特 异性筛选。图5A-5C显示在本专利技术的各实施方式中，检测A431细胞中的两种内源性受 体- β 2-肾上腺素能受体和组胺Hl受体的示范性光学生物反应器细胞试验。图6A-6D显示在本专利技术的各实施方式中，采用RWG生物传感器的示范性双重和靶 标特异性筛选。图7A-7F显示在本专利技术的各实施方式中，采用生物传感器细胞试验示范性筛选化 合物文库中的激动剂结果。图8显示在本专利技术的各实施方式中，采用生物传感器细胞试验示范性筛选化合物 文库中的激动剂结果。图9显示在本专利技术的各实施方式中，采用生物传感器细胞试验示范性筛选化合物 文库中的拮抗剂结果。详述参考附图(如果有的话)详述本专利技术的各种实施方式。参考各种实施方式不是限 制本专利技术的范围，该范围只由随附的权利要求书限制。此外，本说明书中的实施例不是限制 性的，仅是列出本专利技术许多可能的各实施方式中的一些。“试验”、“测定”等术语指分析以测定，例如用外源性刺激，例如用候选配体化合物 刺激后，细胞是否存在光学或生物阻抗反应、其量度、程度、动力学(kinetics)、或动态学 (dynamics)类型。 “结合”、“连接”、“粘附”、“附着”、“粘附的”、“固定的，，等术语通常指通过，例如物理吸附、化学键合等过程或它们的组合，而将(例如)本专利技术的表面修饰物质、增容剂、细 胞、候选配体化合物等实体固定于表面。“细胞连接”、“细胞粘附”等术语，具体指通过(例 如培养)使细胞与表面相互作用或结合，或使细胞与表面，例如生物传感器表面相互作用。 这种生物传感器表面可以是未经修饰或经过修饰的，例如具有表面涂层、锚定材料、增容剂 (例如，纤连蛋白、胶原、核纤层蛋白、明胶、聚赖氨酸等)等修饰，以促进细胞粘附和细胞生 长。对于悬浮细胞，可以(例如)通过培育期间细胞的物理沉降或通过表面与细胞的相互 作用，使细胞与生物传感器检测区接触。可通过以下几种方式实现这种表面-细胞相互作 用，例如共价偶联反应活性表面与基底细胞膜蛋白或分子、电荷为基础的电子相互作用、传 感器表面-呈递分子(例如，抗体、配体)与基底细胞表面分子结合等方法。“粘附细胞”指维持与基材外表面结合、固定于其上或相接触的细胞或细胞系或细 胞系统，例如原核或真核细胞。此类细胞在培育后能经受洗涤和培养液更换过程而存活，而 这些过程是许多细胞试验的先决条件。“弱粘附细胞”指在细胞培养期间与基材表面相互 作用或结合或接触弱的细胞或细胞系或细胞系统，例如原核或真核细胞。然而，物理干扰方 法，例如洗涤或培养液更换易使这些类型的细胞，例如人胚胎肾(HEK)细胞从基材表面脱 离下来。“悬浮细胞”指优选在培养液中培养时不附着或粘附于基材表面的细胞或细胞系。 “细胞培养”指原核或真核细胞在受控制条件下的生长过程。“细胞培养”不仅指培养多细 胞真核生物的细胞，特别是动物细胞，而且指培养复杂的组织、器官等系统。“细胞”等术语指通过半透膜与外部分界的小(通常微观)原生质团，任选包含能 单独执行或与其它类似物质相互作用而执行生命功能的一个或多个核和各种其它细胞器， 形成能独立执行功能的活物质的最小结构单元，包括合成的细胞构造、细胞模型系统和类 似的人造细胞系统。“细胞系统”等术语指细胞的集合，可包括一种以上类型的细胞(或一类细胞的分 化形式)，它们通过彼此相互作用执行生物学或生理学或病理生理学功能。此类细胞系统可 包括，例如器官、组织、干细胞、分化的干细胞和类似的细胞系统。“靶标”等术语指细胞蛋白质或生物分子，其活化可介导细胞信号转导或调节细胞 功能。靶标可以是，例如受体、磷酸酶、激酶、酶、DNA、RNA和类似实体。受体可以是，例如G 蛋白-偶联受体(GPCR)、受体酪氨酸激酶(RTK)、转运蛋白、离子通道、整联蛋白受体、钠/ 质子交换剂和类似实体。激酶可以是，例如蛋白激酶A、蛋白激酶C、有丝分裂原激活的蛋白 (MAP)激酶、胞外信号-调节的激酶、SrC、I h0激酶、灶性黏着激酶和类似实体。酶可以是， 例如膜-结合的腺苷酸环化酶、可溶性腺苷酸环化酶、蛋白酶和类似实体。“双_”、“双重”、“双重的_”等术语指检测由两种不同的靶标，例如Gtl-偶联受体和 Gs-偶联受体，两种不同的Gtl-偶联受体，GPCR和受体酪氨酸激酶，GPCR和酶，GPCR和激酶 及类似组合介导的细胞反应或活性的试验。“多重”、“多重的”等术语指检测由两种以上各个靶标介导的细胞反应或活性的试 验。所述靶标可属于(例如)同一类别的靶标，如GPCR，或不同类别的靶标，如两种GPCR和一种受体酪氨酸激酶。“筛选”等术语指，对(例如)一种或多种化合物或候选药物或生物物质(例如， RNAi、抗体)的系统性研究，检测它们作用于特定靶标、细胞类型或细胞系统的药理学活性。药理学或生物学活性表现为药物对生命物质的有益或有害作用。“模式”、“模式分析”等术语指外推的信息，是关于候选药物、化合物通过一种或多 种细胞靶标，通过特定靶标介导的已知的或预定的信号输出，例如细胞的光学或生物阻抗 反应的幅度，对活细胞或细胞系统的生物学作用的信息。“标记”等术语指，例如能调节至少一种细胞靶标(例如，Gtl-偶联受体、Gs-偶联受 体、Gi-偶联受体、G12/13-偶联受体、离子通道、受体酪氨酸激酶、转运蛋白、钠-质子交换蛋 白、核受体、细胞激酶、细胞蛋白等)的活性，产生可用生物传感器检测的可靠的可检测生 物传感输出信号的分子、生物分子或生物物质。根据所需细胞靶标的类别及其随后的细胞 反应，所述标记可以是活化剂，例如激动剂、部分激动剂、反激动剂，例如GPCR或受体酪氨 酸激酶或离子通道或核受体或细胞腺苷酸环化酶。所述标记也可以是某些类别细胞靶标的 抑制剂，例如肌动蛋白丝或微管的抑制剂；或是激酶，例如Mio激酶的抑制剂，或是细胞表 面分子的抗体，或类似实体，例如抗-表皮生长因子受体抗体。“检测”等术语指本专利技术装置和方法能同时发现或感知至少两种配体诱导的细胞 反应并区分缺乏配体化合物时的感知反应。“鉴定”等术语指本专利技术装置和方法不仅能识别配体化合物对至少两种靶标的影 响，而且能辨别配体化合物特性对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种不用标记的的筛选方法，包括：　　提供生物传感器，在该生物传感器的表面上固定有活细胞，所述活细胞含有至少两种不同靶标；　　使固定的细胞与候选配体接触；　　使经过候选配体处理的细胞与含有两种标记的混合物接触；和　　测定候选配体对标记混合物诱导的生物传感器输出的作用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2008-3-5 61/068,2661.一种不用标记的的筛选方法，包括提供生物传感器，在该生物传感器的表面上固定有活细胞，所述活细胞含有至少两种 不同靶标；使固定的细胞与候选配体接触；使经过候选配体处理的细胞与含有两种标记的混合物接触；和测定候选配体对标记混合物诱导的生物传感器输出的作用。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少两种不同靶标包括用生物传感器 彼此区分的第一靶标和第二靶标。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各标记可选择性调节不同靶标之一的 活性。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述候选配体包括化学化合物、生物学分 子、肽、蛋白质、生物学样品、候选小分子药物、候选生物学分子药物或候选小分子药物-生 物学偶联物中的至少一种。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标包括受体或细胞蛋白质中的至少一种。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述受体包括Gtl-偶联受体、Gs-偶联受体、 Gi-偶联受体、G12/13-偶联受体、受体酪氨酸激酶、离子通道、钠-质子交换蛋白、整联蛋白受 体、转运蛋白中的至少一种。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞蛋白质包括细胞酶、细胞激酶或细 胞结构蛋白中的至少一种。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记包括激动剂、部分激动剂或反激动 剂中的至少一种，所述激动剂活化靶标产生可检测的生物传感器输出信号。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记包括抑制剂或抗体中的至少一种， 所述标记活化靶标产生可检测的生物传感器输出信号。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各标记特异性调节不同靶标的活性。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述靶标包括以下至少一种一对Gtl-偶 联受体、一对Gtl-偶联受体和Gs-偶联受体、一对Gi-偶联受体和Gs-偶联受体、一对G蛋 白-偶联受体和受体-酪氨酸激酶，或一对受体和细胞蛋白质。12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述候选配体对生物传感器输出的作用包 括调节所述标...

【专利技术属性】
技术研发人员：TA邦奇，方晔，E特兰，
申请(专利权)人：康宁股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]