一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用制造技术

本发明专利技术属于核酸药物载体技术领域，具体涉及一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用。所述自组装纳米制剂，包括组分：β‑环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷封端的聚乙二醇和金刚烷修饰的聚酰胺‑胺。本发明专利技术首次发现，当β‑环糊精修饰的聚乙烯亚胺中的聚乙烯亚胺采用低分子量的聚乙烯亚胺，所形成的自组装纳米制剂，对于核酸分子具有非常好的转染效果。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用
本专利技术属于核酸药物载体
，具体涉及一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用。
技术介绍
恶性肿瘤作为死亡的重要原因，正在不断威胁着人类的身体健康，已经成为常见病、多发病。恶性肿瘤死亡率已超过心血管疾病，与病毒性疾病、老年病并称为“现代医学的三大挑战”。对于恶性肿瘤，我们依然无法攻克，尚无完备的治疗手段，只能通过手术切除、化学治疗、放射治疗、和免疫治疗等常规方法。但是随着人类对肿瘤疾病的不断深入了解，近年来在免疫治疗领域取得了突破。肿瘤免疫治疗在近期以来备受关注，是肿瘤治疗领域的焦点和热点。免疫疗法是应用免疫学原理和方法，提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创肿瘤免疫治疗有望成为继手术，化疗，放疗，靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革新。近年来，在免疫治疗领域，通过基因工程改良包括T细胞在内的淋巴细胞作为“活的药物”来消灭癌细胞是癌症疗法的一个新方向。如T细胞疗法的具体过程主要分为九个步骤：(1)将白细胞从患者的血液中分离出来。(2)通过逆流离心淘洗或其它方法富集淋巴细胞。(3)富集的淋巴细胞在体外培养环境中接受特定抗原刺激。(4)同时，通过载体导入编码CAR或TCR的基因片段。(5)这些淋巴细胞在生物反应器中分裂增殖。(6)当淋巴细胞达到足够数量后会经过清洗去除没有表达预订CAR或TCR的T细胞。(7)浓缩后的细胞样本会接受质量检查。(8)然后冰冻成为最终产品运送到诊所。(9)诊所的医生将产品解冻，注回患者体内。在整个治疗过程中其中最为关键的步骤就是通过载体导入基因片段。现阶段较为常见的淋巴细胞转染的方法有病毒介导法，普通电穿孔技术，非病毒载体转染法等。病毒介导法耗时耗力，存在生物安全隐患及高成本等缺点，病毒感染引起的不可预期的免疫反应等缺陷不可被忽视。普通电穿孔技术对免疫相关的原代细胞通常存在转染效率低的问题，也无法进行下游实验。所以安全性高、副作用小、生产成木低的非病毒载体越来越受到人们的青睐，但由于T细胞是悬浮细胞，并且由于其自身的一些生物学性质，目前还没有有效的非病毒载体用于将基因片段高效的运送至T细胞内。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种适用于核酸转染的自组装纳米制剂及其制备与应用。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种自组装纳米制剂，包括组分：β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷封端的聚乙二醇和金刚烷修饰的聚酰胺-胺。优选地，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺可以是接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺。优选地，接枝前的聚乙烯亚胺为低分子量的聚乙烯亚胺。进一步优选地，接枝前的聚乙烯亚胺的分子量范围可以是400～2000。更优选地，接枝前的聚乙烯亚胺的分子量范围可以是600～1800。再优选地，接枝前的聚乙烯亚胺的分子量范围可以是800。优选地，所述接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺中，每条聚乙烯亚胺长链上接枝有一个及一个以上β-环糊精分子。进一步地，每条聚乙烯亚胺长链上接枝有4～7个β-环糊精分子。优选地，所述金刚烷封端的聚乙二醇中，金刚烷可通过酰胺键连接到聚乙二醇的端部。优选地，未封端前的聚乙二醇的分子量可以是2000～5000。优选地，所述金刚烷修饰的聚酰胺-胺可以是连接有金刚烷的聚酰胺-胺。优选地，金刚烷可通过异氰酸酯基团连接到聚酰胺-胺的胺基上。优选地，每个聚酰胺-胺上可以连接有一个及一个以上金刚烷。优选地，所述聚酰胺-胺可以是1代的聚酰胺-胺。优选地，所述自组纳米制剂中，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例范围是(12～72)：(10～20)：(12～48)。本专利技术的第二方面，提供了前述自组装纳米制剂的制备方法，包括：按配比取各组分，混合，自组装获得自组装纳米制剂。优选地，金刚烷封端的聚乙二醇可通过包括如下步骤的方法获得：将金刚烷通过酰胺反应连接到聚乙二醇的端部。优选地，可将金刚烷上的氨基与聚乙二醇上的羧基进行酰胺反应，获得金刚烷封端的聚乙二醇。优选地，金刚烷修饰的聚酰胺-胺可通过包括如下步骤的方法获得：将1-金刚烷异氰酸酯与聚酰胺-胺反应，金刚烷可通过异氰酸酯基团连接到聚酰胺-胺的胺基上。优选地，β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺可通过包括如下步骤的方法获得：将β环糊精与活化剂反应获得活化后的β-环糊精，然后将活化后的β-环糊精接枝到PEI上，获得β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺。优选地，所述活化剂可以是N,N'-羰基二咪唑或对甲苯磺酰氯。优选地，β-环糊精修饰的低分子量聚乙烯亚胺，在制备时，可采用N,N'-羰基二咪唑对β环糊精进行活化。本专利技术的第三方面提供了一种由前述制备方法获得的自组装纳米制剂。本专利技术的第四方面提供了前述自组装纳米制剂在制备核酸转染或输送载体中的用途。所述核酸包括但不限于反义核酸、核酶、适配体、干扰RNA、sgRNA等各种核酸药物及其质粒DNA或mRNA等表达载体，表达各种生物活性分子的质粒DNA或mRNA。所述转染或输送可以是针对体外细胞的，也可以是针对体内细胞的。所述转染的对象为淋巴细胞，优选为T淋巴细胞。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术通过对基于阳离子组分的自组装纳米制剂组成成分的筛选优化，将环糊精修饰不同分子量的聚乙烯亚胺(PEI)，以及金刚烷修饰的不同代数的聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)按照一定的比例混合自主装成为纳米粒子运输核酸片段，在实现有效运输核酸药物的同时，可降低载体的毒副作用，并实现了对淋巴细胞高水平的转染效果。附图说明图1A：实施例1中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺(CD-PEI800)的合成反应式。图1B：实施例1中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺(CD-PEI10000)的合成反应式。图2A：实施例1中β-环糊精修饰的低分子量聚乙烯亚胺(CD-PEI800)的核磁共振氢谱。图2B：实施例1中6-O-(p-对甲基苯磺酸)-β-环糊精(6-OTs-β-CD)的核磁共振氢谱。图2C：实施例1中β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺(CD-PEI10000)的核磁共振氢谱。图3：实施例2中金刚烷封端的聚乙二醇(Ad-PEG)的合成反应式。图4：实施例2中金刚烷-聚乙二醇的核磁共振氢谱。图5：实施例3中金刚烷修饰的聚酰胺-胺(Ad-PAMAM)的合成反应式。图6：实施例4中自组装核酸纳米制剂的粒径分布。图7：实施例4中各自组装核酸纳米制剂的生物透射电镜表征。图8A：含有CD-PEI800的自组装核酸纳米制剂DNA@SNP800在水中的稳定性变化表征。图8B：含有CD-PEI10000的自组装核酸纳米制剂DNA@SNP10000在水中的稳定性变化表征。图9：自组装核酸纳米制剂的凝胶电泳结果，其中，A表示Maker，B表示裸PGL3质粒DNA，C表示PGL3DNA@liposome，D代表PGL3DNA@SNP800，E代表PGL3DNA@SNP10000。图10A：实施例7中自组装核酸纳米制剂介导的荧光素酶表达质粒(PGL3)转染本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自组装纳米制剂，包括组分：β‑环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷封端的聚乙二醇和金刚烷修饰的聚酰胺‑胺。

【技术特征摘要】
1.一种自组装纳米制剂，包括组分：β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷封端的聚乙二醇和金刚烷修饰的聚酰胺-胺。2.根据权利要求1所述的自组装纳米制剂，其特征在于，所述自组纳米制剂中，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺、金刚烷修饰的聚酰胺-胺和金刚烷封端的聚乙二醇之间的摩尔比例范围是(12～72)：(10～20)：(12～48)。3.根据权利要求1所述的自组装纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺选用接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺；(2)所述金刚烷封端的聚乙二醇中，金刚烷通过酰胺键连接到聚乙二醇的端部；(3)所述金刚烷修饰的聚酰胺-胺选用连接有金刚烷的聚酰胺-胺。4.根据权利要求3所述的自组装纳米制剂，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(1)所述接枝有β-环糊精的聚乙烯亚胺中，每条聚乙烯亚胺长链上接枝有一个及一个以上β-环糊精分子；...

【专利技术属性】
技术研发人员：于倩茹，彭金良，徐宇虹，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31