一种单细胞甲基化测序文库的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种单细胞甲基化测序文库的构建方法及其应用。本发明专利技术将多重置换扩增技术应用于单细胞甲基化测序文库的构建，显著扩大了测序文库的丰富度和比对率。具体是，先利用优选的重亚硫酸盐转换试剂盒产生含尿嘧啶的小片段，之后用无标签的随机引物进行数轮扩增延伸，将游离的单链小片段引物降解后，利用高温将配对双链变性，再将单链小片段连接成单链长片段，利用5’末端封闭的无标签随机引物片段进行多重置换扩增，获得扩增终产物，最终对反应产物进行基于Tn5酶的文库构建。

Construction of a single cell methylation sequence library and its application

The invention relates to a method for constructing a single cell methylation sequence library and its application. The invention applies multiple displacement amplification technology to the construction of single cell methylation sequencing library, which greatly expands the richness and ratio of the sequencing library. In particular, the preferred bisulfite conversion kit containing uracil fragments, after using random primers without labels conducted several rounds of amplification of single stranded small fragments of primer extension, degradation free, using high temperature paired double chain degeneration, then connected into a single stranded small fragment fragment, using 5 'closed end label free random primer fragment was amplified multiple displacement amplification, the end product of the reaction products were enzyme based on the construction of Tn5 library.

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞甲基化测序文库的构建方法及其应用
本专利技术涉及基因检测领域。具体地说，涉及一种单细胞全基因组甲基化测序文库的构建方法及其应用。
技术介绍
DNA甲基化是基因组DNA的一种重要表观遗传方式，是在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化现象广泛存在于细菌、植物和动物中，参与生物体的多种生物学过程(LawJAandJacobsenSE，Establishing，maintainingandmodifyingDNAmethylationpatternsinplantsandanimals[J].NatRevGenet，2010.11(3)：204-220.)。在植物中，DNA甲基化具有物种、组织、器官、细胞、发育阶段等时空特异性，在植物生长发育、适应环境条件以及进化过程中起着重要的调节作用(FujimotoR，SasakiT，KudohH，etal.，EpigeneticvariationintheFWAgenewithinthegenusArabidopsis[J].PlantJ，2011.66(5)：831-843.)。表观遗传学的研究现已成为热点，用于检测DNA甲基化的方法也随之不断涌现。常用检测方法包括基于凝胶分析方法、基于基因芯片分析、基于高通量测序方法、高效液相色谱柱(highperformanceliquidchromatography，HPLC)、甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法、结合亚硫酸氢盐的限制性内切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA)、甲基化荧光检测(methylight)、限制性标记基因组扫描(restrictionlandmarkgenomicscanning，RLGS)和MBD柱层析与MS-RE联用技术(combinationofmethylated-DNAprecipitationandmethylation-sensitiverestrictionenzymes，COMPARE-MS)等。目前已报道的单细胞DNA甲基化测序的方法有两种：一种是单细胞简化代表性重亚硫酸盐测序(single-cellreduced-representationbisulfitesequencing，scRRBS)(GuoH，ZhuP，WuX，etal.，Single-cellmethylomelandscapesofmouseembryonicstemcellsandearlyembryosanalyzedusingreducedrepresentationbisulfitesequencing[J].GenomeRes，2013.23(12)：2126-2135.)和单细胞重亚硫酸盐测序(single-cellbisulfitesequencing，scBS)(SmallwoodSA，LeeHJ，AngermuellerC，etal.，Single-cellgenome-widebisulfitesequencingforassessingepigeneticheterogeneity[J].NatMethods，2014.11(8)：817-820.)。scRRBS是第一个专利技术出来的单细胞甲基化测序方法。该方法采用先酶切CG位点再重亚硫酸盐转换并富集扩增的策略，仅能低覆盖率地检测GC酶切位点附近的甲基化；植物中由于存在大量的CHG和CHH甲基化类型，所以scRRBS并不适合植物中的分析。scBS操作原理是先对基因组进行重亚硫酸盐转换、片段化，然后再用随机引物对小片段进行两步扩增，能获得相比scRRBS更大的覆盖度及更无偏的甲基化位点信息，但亚硫酸盐转换产生的小片段的长度直接影响了文库的覆盖度(过长和过短的片段都无法进行测序)。较之前的scRRBS和scBS技术，本专利技术中涉及的基于多重置换扩增的单细胞重亚硫酸盐测序(multipledisplacementamplificationsingle-cellbasedbisulfitesequencing，MB-scBS，简称MB-seq)，可以忽略重亚硫酸盐转换产生的片段长短对文库片段长度的影响，利用该方法构建的测序文库的丰度和比对率更高，可适用于动物、微生物，尤其是植物的单细胞甲基化测序。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种单细胞全基因组DNA甲基化测序文库的构建方法，以及用于生产单细胞基因组DNA甲基化测序的试剂盒，以提高单细胞尤其是来源于植物的单细胞全基因组DNA甲基化测序文库的覆盖度和比对率，同时提高测试数据的重复性和稳定性。为了实现本专利技术目的，本专利技术先利用优选的重亚硫酸盐转换试剂盒产生含尿嘧啶的小片段，后用无标签的随机引物进行数轮扩增，将游离的单链小片段引物洗去后，利用高温将配对双链变性，再将单链小片段连接成单链长片段，利用5’末端封闭的无标签随机引物片段进行MDA扩增，获得扩增终产物，最终对反应产物进行基于Tn5酶的文库构建。具体来说，本专利技术方法包括如下步骤：1)单细胞转化DNA的获得；2)DNA的富集；3)富集DNA的建库；4)文库定量和上机测序。其中步骤1)进一步包括：①分离单个细胞或细胞核；②将单细胞或细胞核进行裂解，得到单细胞样本；③将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶；④纯化产物DNA片段。其中步骤2)进一步包括：⑤短片段富集合成反应；⑥磁珠纯化并去除单链引物；⑦酶连反应；⑧多重置换扩增(MDA)；⑨磁珠纯化。其中步骤3)进一步包括：⑩扩增产物浓度测定；基于Tn5的DNA测序文库的构建；文库纯化与片段分选。该专利技术方法中步骤1)、2)和3)的组合是必要的：单细胞的转化DNA获得(步骤1)后，使用本方法的DNA富集步骤是非常有效的(步骤2)，富集后的产物只能搭配Tn5基于的建库步骤建库测序(步骤3)。其中步骤1)-2)将MDA的扩增方法引入了重亚硫酸盐测序的检测方法。步骤3)是基于Tn5的DNA建库试剂盒(TruePrepDNALibraryPrepKitV2for)建库。其中步骤①中以27％的山梨醇溶液平衡胞内渗透压，维持正常的细胞形态。利用显微操作系统，单个细胞可以被分离到，能够用于DNA重亚硫酸盐测序的检测。步骤2)先将小片段富集，当浓度累积到一定程度以后，除去单链的随机引物小片段，将小片段酶连成长片段以后再进行MDA扩增。这样的操作利用重亚硫酸盐转化后的小片段富集。步骤⑤用不含标签的随机序列作为引物的。由于引物上不带有含barcode的特异序列，降低了运算量和无谓的成本，提高了数据的准确性。步骤⑧利用不含标签的5’末端生物素修饰的随机序列作为引物，由于生物素修饰对5’末端的封闭作用，避免了T4RNALigase将随机引物链接成长链，可以减少非特异性链的产生。附图说明图1.MB-seq的操作流程图。灰色表示原始的DNA单链，黑线表示加入的引物和利用引物合成的DNA片段，小圆点表示引物及序列末端的生物素修饰封闭。图2.scBS和MB-seq的文库扩增电泳图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单细胞全基因组甲基化测序的文库构建方法，该方法包括如下步骤：1)单细胞转化DNA的获得；2)DNA的富集；3)富集DNA的建库。

【技术特征摘要】
1.一种单细胞全基因组甲基化测序的文库构建方法，该方法包括如下步骤：1)单细胞转化DNA的获得；2)DNA的富集；3)富集DNA的建库。2.权利要求1所述的方法，其中步骤1)进一步包括如下步骤：①分离单个细胞或细胞核；②将单细胞或细胞核进行裂解，得到单细胞样本；③将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶；④纯化产物DNA片段。3.权利要求1所述的方法，其中步骤2)进一步包括如下步骤：⑤短片段富集合成反应；⑥磁珠纯化并去除单链引物；⑦酶连反应；⑧多重置换扩增(MDA)；⑨磁珠纯化。4.权利要求1所述的方法，其中步骤3)进一步包括如下步骤：⑩扩增产物浓度测定；基于Tn5的DNA测序文库的构建；文库纯化与片段分选。5.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单细胞来源于植物、微生物或动物。6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的单细胞来源优选植物。7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的植物优选玉米。8.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：李响，严建兵，陈露，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42