一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法技术

本发明专利技术公开了一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，包括以下步骤：S1，合成用于构建扩增子文库的引物组合；S2，合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物；S3，对提取后的样本DNA进行磁珠纯化；S4，目标区域多重PCR扩增；S5，PCR添加测序接头序列；S6，链霉亲和素‑生物素捕获目的文库。本发明专利技术可以简便、快速的经过两轮PCR完成扩增子文库的构建，并且在缩短文库构建及文库定量的时间的同时极大的降低了文库构建及文库定量的成本。

A library construction and quantitative method for detection of tumor driven genes

Construction and quantitative methods of Library of the invention discloses a gene detection drive to the tumor, which comprises the following steps: S1, for the construction of synthetic primer combination amplicon library; S2 synthesis for Torrent adaptor primers to construct the final unscheduled library; S3, for purification of sample beads after extraction of DNA; S4 target the multiple PCR amplification; S5, PCR S6, added sequencing joint sequence; streptavidin biotin capture library to. The invention can complete the amplification library construction by two rounds of PCR, and shorten the time of library construction and library quantification, and greatly reduce the cost of library construction and library quantification.

【技术实现步骤摘要】
一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种基于IonTorrent测序平台的一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法。
技术介绍
随着大规模平行测序(二代测序)成本的不断降低以及目标区域捕获技术的不断成熟，基于二代测序技术的基因检测得到越来越多的应用。二代测序与传统检测方法相比，具有灵敏度高，准确性高，价格低廉，可以同时检测多种靶点的优势。市面上主流的测序平台主要有两个，分别是Illumina公司的荧光可逆性终止法测序以及ThermoFisher公司的半导体离子流测序(IonTorrent)。IonAmpliseqTM是ThermoFisher公司开发的基于多重PCR对目标区域进行捕获的技术。其工作流程大致分成以下几步：1、目标区域捕获，采用扩增子技术及多重PCR技术，将感兴趣的目标区域捕获下来；2、引物的消化，通过核酸内切酶及UNG酶将多余的引物序列消化掉；3、接头连接，通过连接酶将IonProton的接头序列连接到目标区域两端；4、文库定量，通过标准品绘制标准曲线，对构建好的文库进行定量。但是，传统的Ampliseq建库技术操作比较复杂，需要大约5个小时。并且，在连接接头的过程中通过连接酶进行连接，文库损失率高；文库构建完成后还需要进行qPCR定量，操作及仪器运行时间大约需要2个小时，因此，建库加定量的总体时间超过了7个小时，这对于对时间周期要求高的临床肿瘤基因检测而言是很难接受的。另外，在传统的Ampliseq构建扩增子文库的方法中，单个样品构建文库的成本较高，大约为400-600元/例；传统的Ampliseq定量方法为基于Taqman法的荧光实时定量，单个样品的定量成本也较高，大约为80元/例。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种基于IonTorrent测序平台的应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，与传统方法相比，可以简便，快速的经过两轮PCR完成扩增子文库的构建，并且在第二轮PCR的同时完成文库的定量。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，包括以下步骤：(1)合成用于构建扩增子文库的引物组合；(2)合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物；(3)对提取后的样本DNA进行磁珠纯化；(4)目标区域多重PCR扩增；(5)PCR添加测序接头序列；(6)链霉亲和素-生物素捕获目的文库。具体，包括以下步骤：(1)目标区域多重PCR，合成用于构建扩增子文库的引物组合根据目标区域设计扩增子的上游特异性引物，上游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第一序列和根据目标区域扩增子设计的特异性上游引物序列；根据目标区域设计扩增子的下游特异性引物，下游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第二序列和根据目标区域扩增子设计的特异性下游引物序列；(2)合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物根据IonProton测序平台P端接头序列设计上游通用引物序列；根据IonProton测序平台A端接头序列设计下游通用引物序列；上游引物5’端进行生物素标记修饰，用于后续的基于生物素-亲和素体系的文库定量；(3)对提取后的DNA进行磁珠纯化采用1.8倍的AMPureXP磁珠对提取后的样本DNA溶液进行纯化，有效去除小于100bp的DNA片段，提高模板的有效浓度；(4)目标区域多重PCR扩增1)配制用于目标区域扩增的PCR反应体系，将步骤(1)所述的含有第一、第二通用序列的目标区域特异性上下游引物按照相同的摩尔浓度进行混合，最终使得每一条引物的终浓度为200nM，以作为目标区域扩增的PCR反应体系中的引物组合；第一步PCR反应体系包含以下组分：PCR预混液10ul纯化后的DNA样品20ng目标区域扩增PCR引物组合4ul，200nM无酶水补齐至20ul所述PCR预混液为PlatinumSuperFiMasterMix，ThermoFisher，cat#12358010PCR反应程序为：2)1.0倍AMPureXP磁珠纯化PCR产物，纯化掉引物二聚体以及在上一步没有完全反应的多余引物组合；(5)PCR添加测序接头序列进行PCR添加测序接头反应，对目标区域扩增多重PCR反应完成后的目标区域进行富集，同时引入IonProton测序平台的测序接头序列；PCR添加测序接头反应包含以下组分：PCR预混液25ul纯化后的DNA样品23ul1uMPCR上游引物1ul1uMPCR下游引物1ul所述PCR预混液为KAPAHiFiMasterMix，KAPA，cat#kk2602PCR反应程序为：(6)链霉亲和素-生物素捕获目的文库采用链霉亲和素磁珠DynabeadsMyoneStreptavidinT1，Thermo，cat#65601对含有生物素标记的PCR产物进行捕获，最后采用1N的NaOH进行洗脱，将目标文库与磁珠分离，即得到均一化之后的文库。所述样本DNA为基因组DNA。所述基因组DNA提取自组织样本或福尔马林固定石蜡包埋组织。用于构建扩增子文库的引物组合包含两部分，基因特异性引物和通用第一序列以及通用第二序列,通用第一序列和通用第二序列的核苷酸序列为：第一通用序列：5’-CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’SEQIDNO:1第二通用序列：5’-GATGCTCTTCCGATCT-3’SEQIDNO:2。采用1.8倍的AMPureXP磁珠对提取后的样本DNA溶液进行纯化。PCR添加测序接头时，所用的引物浓度为固定值，其中上游引物的5’端采用生物素标记；下游引物含有barcode序列,上下游引物序列为：上游引物序列：5’-bio-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGT-3’SEQIDNO:3下游引物序列：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATGCCATGGATCGATGCTCTTCCGATCT-3’SEQIDNO:4其中下游引物31位至40位碱基序列做为barcode用于区分不同样本，可用不同序列取代。本专利技术的有益效果：与传统方法相比，可以简便、快速的经过两轮PCR完成扩增子文库的构建，并且在PCR添加测序接头的同时完成文库的定量。从而大大减少文库构建及文库定量的时间，该方法还能将单个样品构建文库及文库定量的成本控制在30元/例。附图说明图1为本专利技术实施方式的IonTorrent测序平台的文库构建和文库定量流程示意图；图2为本专利技术实施方式的文库定量的原理示意图；图3为实施例中每个文库的预期产出数据与实际产出数据的比较图；图4为实施例中每个文库的所有扩增子的测序深度分布图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：如图1、2所示，本专利技术应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，包含以下步骤：1.合成用于构建扩增子文库的引物组合(目标区域扩增)。包括：根据目标区域设计扩增子的上游特异性引物，所述上游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第一序列和根据目标区域扩增子设计的特异性上游引物序列；根据目标区域设计扩增子的下游特异性引物，所述下游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第二序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成用于构建扩增子文库的引物组合；(2)合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物；(3)对提取后的样本DNA进行磁珠纯化；(4)目标区域多重PCR扩增；(5)PCR添加测序接头序列；(6)链霉亲和素‑生物素捕获目的文库。

【技术特征摘要】
1.一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成用于构建扩增子文库的引物组合；(2)合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物；(3)对提取后的样本DNA进行磁珠纯化；(4)目标区域多重PCR扩增；(5)PCR添加测序接头序列；(6)链霉亲和素-生物素捕获目的文库。2.根据权利要求1所述应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)目标区域多重PCR，合成用于构建扩增子文库的引物组合根据目标区域设计扩增子的上游特异性引物，上游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第一序列和根据目标区域扩增子设计的特异性上游引物序列；根据目标区域设计扩增子的下游特异性引物，下游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第二序列和根据目标区域扩增子设计的特异性下游引物序列；(2)合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物根据IonProton测序平台P端接头序列设计上游通用引物序列；根据IonProton测序平台A端接头序列设计下游通用引物序列；上游引物5’端进行生物素标记修饰，用于后续的基于生物素-亲和素体系的文库定量；(3)对提取后的DNA进行磁珠纯化采用1.8倍的AMPureXP磁珠对提取后的样本DNA溶液进行纯化，有效去除小于100bp的DNA片段，提高模板的有效浓度；(4)目标区域多重PCR扩增1)配制用于目标区域扩增的PCR反应体系，将步骤(1)所述的含有第一、第二通用序列的目标区域特异性上下游引物按照相同的摩尔浓度进行混合，最终使得每一条引物的终浓度为200nM，以作为目标区域扩增的PCR反应体系中的引物组合；第一步PCR反应体系包含以下组分：PCR预混液10ul纯化后的DNA样品20ng目标区域扩增PCR引物组合4ul，200nM无酶水补齐至20ul所述PCR预混液为PlatinumSuperFiMasterMix，ThermoFisher，cat#12358010PCR反应程序为：2)1.0倍AMPureXP磁珠纯化PCR产物，纯化掉引物二聚体以及在上一步没有完全反应的多余引物组合；(5)PCR添加测序接头序列进行PCR添加测序接头反应，对目标区域扩增多重PCR反应完成后的目标区域进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗玺，李同恩，张振宇，赵鹏，林鑫，刘明明，朱兵，师鸿翔，
申请(专利权)人：中源协和基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12