一种青霉素酰化酶固定化载体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种青霉素酰化酶固定化载体的制备方法。本发明专利技术以表面活性剂作为分散剂，以乙烯基化合物为单体，采用反相悬浮技术进行交联聚合，从而获得青霉素酰化酶固定化载体。载体固定化青霉素酰化酶（ＩＭＥ）对青霉素Ｇ钾盐水解制备６－ＡＰＡ的表观酶活，可达１２５ＩＵ／ｇ以上。本发明专利技术的方法所获得的含环氧基团聚合物珠状载体，表观酶活高，工艺过程简单，操作方便，原料价廉易得，易于工业化规模生产。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酶的固定化载体，具体地说，涉及青霉素酰化酶固定化载体，更具体涉及含环氧基团的珠状交联聚合物的青霉素酰化酶固定化载体的制备方法。固定化青霉素酰化酶用于半合成青霉素的关键中间体6-氨基青霉烷酸(6-APA)的工业化生产已有近30年的历史。然而，迄今为止有关青霉素酰化酶固定化载体的合成、制备工艺以及化学修饰方面的文献、专利报道仍屡见不鲜。概括地讲，研究主要集中在两个方面，一是通过引入官能团或借助化学修饰等手段，开发性能更加优异的新型载体材料。其次是探索新的合成路线和方法，以改进现有的生产工艺条件，降低固定化载体的制备成本。目前工业上普遍选用含环氧基团的珠状交联聚合物作为青霉素酰化酶固定化载体。由于环氧基具有一定的化学活性，在十分温和的条件(20-25℃)下，即可开环与酶分子中的胺基产生共价键合，从而实现酶的固定化。这种借助环氧基团使生物酶固定于珠状载体，不仅操作方法简便，更适合于连续化反应流程，而且由于酶分子与载体之间的共价结合，固定化酶呈现出良好的稳定性和重复使用性。美国专利4,511,694公开了一种以正庚烷-四氯乙烯混合物作为分散相，采用聚合物乳化剂作为分散剂，至少以两种以上的乙烯基化合物为聚合单体所制备的富含环氧基的珠状载体。世界专利9,940,122公开了一种采用反相悬浮技术制备这类固定化载体。具体方法是以相对廉价的环己烷为分散相，采用季铵盐共聚物作为保护剂，在65-75℃下甲基丙烯酸缩水甘油酯等多种乙烯基化合物进行交联共聚所获得的含环氧基的珠状载体。众所周知，反相悬浮聚合工艺中，与聚合体系相匹配的分散剂的选择是至关重要的，因为它直接影响到珠状聚合物的形成和粒径分布。上述载体均选用高分子聚合物作为分散剂，存在原料制备复杂，产率低，使得固定化载体的制备成本高等缺点。因此，研究开发一种新的价廉的青霉素酰化酶固定化载体是相关的产业部门所十分期望的。本专利技术的技术方案本专利技术以表面活性剂作为分散剂，以乙烯基化合物为单体，采用反相悬浮技术进行交联聚合，从而获得青霉素酰化酶固定化载体。本专利技术的青霉素酰化酶固定化载体的制备方法包括如下步骤(1)将表面活性剂溶解于有机分散相中。(2)将乙烯基化合物溶解于甲酰胺中或者甲醇与水的混合物中，若选用后者，甲醇溶液的浓度为20-80wt％，优选的为40-60％；水浴加热温度控制在45-75℃，优选的为50-60℃；加入一定质量的偶氮二异丁腈，其用量为乙烯基化合物的1-8％，优选的为2-4％。(3)将(2)中的混合溶液迅速转入(1)中进行分散，控制搅拌速度为200-600r/min，优选的为300-450r/min；在氮气保护下进行聚合，反应时间为3-8小时，优选的为5-6小时。反应结束后，从反应产物中收集珠状载体，并进行纯化。其中分散相的质量为乙烯基化合物的200-800％，优选的为300-550％；水浴加热至50-75℃，优选的为55-65℃；表面活性剂的重量为乙烯基化合物的3-30％，优选的为1-15％。所说的乙烯基化合物包括丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、N-乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸缩水甘油酯、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺或N，N’-亚甲基双甲基丙烯酰胺中的两种或两种以上。所采用的分散相包括环己烷、正庚烷或四氯乙烯中的一种或一种以上。所采用的表面活性剂包括司班-80、司班-60、硬脂酸钙、聚乙二醇或十二烷基硫酸钠中的两种或两种以上。采用文献所公开的对二甲胺苯甲醛(PDAB)法，测定载体固定化青霉素酰化酶(IME)对青霉素G钾盐水解制备6-APA的表观酶活，可达125IU/g(以湿重表示)以上。由上述公开的技术方案可以看到，本专利技术的方法所获得的含环氧基团聚合物珠状载体，表观酶活高，工艺过程简单，操作方便，原料价廉易得，易于工业化生产。实施例1将870毫升的正庚烷与280毫升的四氯乙烯混合后注入装有温度计、导气管和搅拌机的四口烧瓶中，加入0.4克的表面活性剂司班-60和50克硬脂酸钙后加热至55℃。待混合均匀后再加入160毫升溶有32克N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、10克丙烯酰胺和20克甲基丙烯酸缩水甘油酯以及0.5克引发剂偶氮二异丁腈的甲酰胺溶液。通入纯氮，聚合6小时后停止搅拌。产物经过滤、丙酮洗涤、抽提后，真空干燥至恒重。采用对二甲胺苯甲醛(PDAB)法测定此载体固定化青霉素酰化酶(IME)对青霉素G钾盐水解制备6-APA的表观酶活为110IU/g。实施例2与实施例1不同之处是在四口烧瓶上安装水分离器，同时单体相中的稀释剂以甲醇与水的混合溶液代替甲酰胺。聚合体系中加入112克的甲醇和40克的水，其余组分的用量和制备条件与实施例1相同。测得相应的固定化青霉素酰化酶表观酶活为125IU/g。实施例3反应装置同实施例2。将850毫升的环己烷加入四口瓶中，加入0.6克司班-60和32克硬脂酸钙后加热至55℃，待司班-60溶解体系达到均匀混合后，加入以156毫升60wt％甲醇水溶液溶解的28克N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、20克甲基丙烯酸缩水甘油酯和0.5克偶氮二异丁腈混合物溶液，分散均匀后通入氮气。经6小时聚合，大部分水进入水分离器与体系分离，此时停止反应。产品的后处理同实施例1。测得相应的固定化青霉素酰化酶表观酶活为92IU/g。权利要求1.一种青霉素酰化酶固定化载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)将表面活性剂溶解于分散相中；(2)将乙烯基化合物溶解于甲酰胺中或甲醇与水的混合物中，加热至45-75℃，加入偶氮二异丁腈，其用量为乙烯基化合物的1-8wt％；(3)将步骤(2)中的混合溶液转入步骤(1)的溶液中搅拌分散，在氮气保护下进行聚合，反应时间为3-8小时，反应结束后，从反应产物中收集珠状载体；其中分散相的质量为乙烯基化合物的200-800％，表面活性剂的重量为乙烯基化合物的3-30％；所说的分散相包括环己烷、正庚烷或四氯乙烯中的一种或一种以上。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的乙烯基化合物包括丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、N-乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酸缩水甘油酯、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺或N，N’-亚甲基双甲基丙烯酰胺中的两种或两种以上。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所采用的表面活性剂包括司班-80、司班-60、硬脂酸钙、聚乙二醇或十二烷基硫酸钠中的两种或两种以上。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，甲醇溶液的浓度为20-80wt％。5.一种青霉素酰化酶固定化载体，其特征在于是这样制备的(1)将表面活性剂溶解于分散相中；(2)将乙烯基化合物溶解于甲酰胺中或甲醇与水的混合物中，加热至45-75℃，加入偶氮二异丁腈，其用量为乙烯基化合物的1-8wt％；(3)将步骤(2)中的混合溶液转入步骤(1)的溶液中搅拌分散，反应时间为3-8小时，反应结束后，从反应产物中收集珠状载体；其中分散相的质量为乙烯基化合物的200-800％，表面活性剂的重量为乙烯基化合物的3-30％；所说的分散相包括环己烷、正庚烷或四氯乙烯中的一种或一种以上。6.如权利要求5所述的固定化载体，其特征在于所说的乙烯基化合物包括丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、N-乙烯吡本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青霉素酰化酶固定化载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤： （１）将表面活性剂溶解于分散相中； （２）将乙烯基化合物溶解于甲酰胺中或甲醇与水的混合物中，加热至４５－７５℃，加入偶氮二异丁腈，其用量为乙烯基化合物的１－８ｗｔ％； （３）将步骤（２）中的混合溶液转入步骤（１）的溶液中搅拌分散，在氮气保护下进行聚合，反应时间为３－８小时，反应结束后，从反应产物中收集珠状载体； 其中：分散相的质量为乙烯基化合物的２００－８００％，表面活性剂的重量为乙烯基化合物的３－３０％； 所说的分散相包括环己烷、正庚烷或四氯乙烯中的一种或一种以上。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卢冠忠，薛屏，乌云高娃，郭杨龙，王筠松，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]