一种鹅细小病毒感染性克隆的拯救方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)感染性克隆的拯救方法。该方法是将GPV的完整基因组克隆入载体质粒pBSKNB，获得重组质粒；将重组质粒与转染试剂混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种非免疫鹅胚，重组质粒在鹅胚中得到拯救；所述pBSKNB载体，是将pBluescript II(SK)质粒上原有的EcoRV和HindIII酶切位点分别用NcoI和BclI位点替换而得到。本发明专利技术产生的感染性病毒可致死鹅胚，拯救病毒与亲本病毒具有一致生物学特性。该拯救方法操作简便高效，避免了转染细胞带来的繁琐和低效问题，在GPV反向遗传学研究和疫苗创制上具有潜在应用价值。

Rescue method for infectious clone of Goose Parvovirus

The present invention relates to the field of biotechnology, in particular to a goose parvovirus (Goose parvovirus, GPV) rescue of infectious clone. This method is the complete GPV genome was cloned into plasmid pBSKNB. The recombinant plasmid; the recombinant plasmid was mixed with transfection reagent, the chorioallantoic membrane inoculating goose embryo, the recombinant plasmid was saved in goose embryo; the pBSKNB vector is pBluescript II (SK) was the original EcoRV and HindIII restriction sites were replaced by NcoI and BclI were obtained. The infectious virus produced by the invention can kill the goose embryo, and the rescue virus has the same biological characteristics with the parent virus. The rescue method is simple and efficient, and avoids the tedious and inefficient problems caused by transfected cells, and has potential application value in GPV reverse genetics research and vaccine creation.

【技术实现步骤摘要】
一种鹅细小病毒感染性克隆的拯救方法
本专利技术属于生物
，涉及一种GPV感染性克隆质粒转染鹅胚拯救病毒的简便高效方法。
技术介绍
我国的养鹅业居于世界首位，也是鹅肉消费大国。鹅细小病毒是1月龄内雏鹅的一种重要疫病，死亡率可高达90％，该病自上世纪50、60年代在国内流行。目前虽已研制了弱毒疫苗供种鹅或雏鹅使用，但该病并未从田间消失，仍然持续性对养鹅业造成经济损失。反向遗传技术是开展病毒研究的一种有用平台，在阐明病毒致病机制和疫苗研制中能够发挥重要作用。同样，构建鹅细小病毒感染性分子克隆，以此为基础可以对GPV的特定基因展开更为有效的研究，也是GPV疫苗研制的一个有用平台。病毒拯救是反向遗传操作上的重要一环，大多是将构建的质粒或RNA转录产物转染细胞的途径来实现拯救目的。转染原代的鹅胚成纤维细胞拯救感染性GPV也有报道，对于细小病毒而言，细胞处于分裂期时才最适于病毒复制，因此转染时细胞所处状态对转染拯救结果影响很大。总体来看，在细胞上进行转染不仅费事，拯救效率也不高。因此，若能建立一种简便、高效的拯救方法，将极大的方便并推动GPV相关基础研究的深入开展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简便高效的鹅细小病毒(Gooseparvovirus,GPV)感染性克隆质粒的拯救方法。本专利技术所述的鹅细小病毒感染性克隆质粒的拯救方法，是将GPV的完整基因组克隆入载体质粒pBSKNB，获得重组质粒，将重组质粒与转染试剂混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种非免疫鹅胚，重组质粒在鹅胚中得到拯救；所述pBSKNB载体，是将商品化的pBluescriptII(SK)质粒上原有的EcoRV和HindIII酶切位点分别用NcoI和BclI位点替换而得到。具体地：将重组质粒与转染试剂Lipofectamine2000按照一定比例1:2.5(μg/μl)比例混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种11日龄非免疫鹅胚。鹅胚在接种后120h～192h之间死亡，胚体具有典型的GPV感染特征，表现为胚体出血、绒毛尿囊膜水肿的典型特征。拯救出的病毒具有与亲本病毒相近的生物学特性。进一步地，为了排除转染拯救过程中亲本GPV毒株污染的可能，可通过overlapPCR方法，在重组质粒的克隆基因组内部引入两个同义碱基突变作为遗传标记，得到的带有遗传标记的重组质粒再施以转染及拯救过程。更具体地，可以是在重组质粒的VP1基因中引入两个突变碱基作为遗传标记。本专利技术中，所述的重组质粒是插入GPVLH株完整基因组pLH质粒，或者是插入GPVLH株完整基因组并引入遗传标记的pLHΔ质粒，但是，本专利技术的拯救方法适用于但不仅限于插入GPVLH株完整基因组的pLH质粒或pLHΔ质粒。对其它GPV强毒分离株或者鹅胚化弱毒株，以本
技术实现思路
公开的相同构建方法克隆其全基因组，获得重组质粒，重组质粒的拯救方法同pLH质粒或pLHΔ质粒。本专利技术所述的质粒pLH，它的构建方法在于：超速离心浓缩GPVLH株病毒，提取病毒的基因组单链DNA，体外退火后生成双股DNA。选用BclI和NcoI酶切基因组DNA生成亚基因组片段，分别克隆入自行改造的pBSKNB载体的相应酶切位点，再通过酶切-连接的常规分子操作，拼接获得含有完整基因组的质粒pLH。进一步地，通过overlapPCR方法，在pLH质粒的VP1基因中引入两个同义突变碱基作为遗传标记，获得质粒pLHΔ。本专利技术中所述相近的生物学特性是指在鹅胚半数致死量(ELD50)和感染试验中的雏鹅死亡率这两个关键指标上，拯救病毒具有与亲本病毒相近的数值。本专利技术公开了LH株的完整基因组序列。LH株基因组由5047个碱基组成(SEQIBNO.5)，LH株的ITR由414个碱基组成，其中375个碱基形成回文结构，其余39个碱基构成D区序列。基因组左侧的ITR的D区序列与右侧ITR的D′序列反向互补，这一特性将使得基因组分子能够形成一个更大范围的回文。作为一个具体的操作，本专利技术公开了一种GPV全基因组克隆的构建方法，该方法对其它GPV毒株同样适用，它包括如下步骤：(1)GPV核酸的提取GPVLH株在鹅胚中增殖，收集的尿囊液分别经差速和超速离心浓缩到原有体积的1/50。采用SDS-蛋白酶K消化法提取病毒核酸。经95℃变性10min，缓慢冷却至65℃退火，使单股DNA形成双股DNA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，可观察到约5.1kb基因组DNA。(2)全基因组克隆的构建将提取的GPVLH株基因组双股DNA用NcoI和BclI限制性内切酶进行双酶切，产生的左中右三个片段大小分别为0.6kb、3.2kb和1.3kb，各片段切胶回收。将0.6kb的左片段克隆入载体质粒pBSKNB的HincII-BclI之间，产生pBSKNB-L质粒。将3.2kb的中间片段插入质粒pBSKNB的BclI-NcoI之间，产生pBSKNB-M质粒。将1.3kb的右片段插入pBSKNB的NcoI-SmaI位点之间，获得pBSKNB-R质粒。在成功克隆亚基因组片段并测序的基础上，通过常规的酶切-连接操作，将各亚基因组片段正确的拼接，从而获得包含LH株完整基因组的克隆质粒pLH。本专利技术还公开了pLH质粒中遗传标记引入的方法，以便于将拯救病毒与亲本病毒LH株区分开(见附图5)。在pLH质粒的VP1基因中引入两个突变碱基作为遗传标记，不改变氨基酸组成，获得质粒pLHΔ。利用LH株基因组内部在拟突变位点两侧分别存在单一的SexAI和NcoI位点的条件，设计了一组overlapPCR引物，引物代号和序列分别为：overlap-1:GCAGGAACAATTACCAGGTACG(SexAI)(SEQIBNO.1)overlap-2:GTGGTCGGTAGTTCCCTGT(SEQIBNO.2)overlap-3:ACAGGGAACTACCGACCAC(SEQIBNO.3)overlap-4:CGGCCCATGGTGCCATAAGC(NcoI)(SEQIBNO.4)方框内部为突变碱基，两个突变碱基分别为G→A突变和T→C突变，突变碱基用方框表示。Overlap-1引物和Overlap-4引物内部分别含有SexAI和NcoI位点。通过overlapPCR,结合酶切连接操作，能够将2个突变碱基引入pLH质粒，获得质粒pLHΔ。本专利技术还公开了pLHΔ质粒通过绒毛尿囊膜转染鹅胚拯救病毒的具体方法：采用Lipofectamine2000作为转染试剂。质粒和转染试剂的比例按照1：2.5(μg：μl)进行。吸取16μgpLHΔ质粒溶液至1个灭菌的1.5ml离心管中，用opti-DMEM培养液(Invitrogen，美国)稀释至1ml；另一个离心管内加入40μlLipofectamine2000转染试剂，加入960μlOpti-DMEM培养液混匀。将稀释后的质粒和转染试剂静置5min后，轻柔混匀，室温静置20min后即可进行转染。每只鹅胚通过绒毛尿囊膜接种0.25ml,其中包含2.0μg质粒。鹅胚在接种后第5天开始出现死亡，至转染后第8天，死亡率达到75％。拯救病毒在鹅胚上能够成功传代。本专利技术对拯救病毒的生物性特性进行了测定。结果表明：拯救病毒的鹅胚半数致死量(ELD50)达到每毫升5×104.77,与亲本LH株极为相似，后者的E本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鹅细小病毒(GPV)感染性克隆质粒的拯救方法，其特征在于，是将GPV的完整基因组克隆入载体质粒pBSKNB，获得重组质粒；将重组质粒与转染试剂混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种非免疫鹅胚，重组质粒在鹅胚中得到拯救；所述pBSKNB载体，是将pBluescript II(SK)质粒上原有的EcoRV和HindIII酶切位点分别用NcoI和BclI位点替换而得到。

【技术特征摘要】
1.一种鹅细小病毒(GPV)感染性克隆质粒的拯救方法，其特征在于，是将GPV的完整基因组克隆入载体质粒pBSKNB，获得重组质粒；将重组质粒与转染试剂混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种非免疫鹅胚，重组质粒在鹅胚中得到拯救；所述pBSKNB载体，是将pBluescriptII(SK)质粒上原有的EcoRV和HindIII酶切位点分别用NcoI和BclI位点替换而得到。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：将重组质粒与转染试剂Lipofectamine2000按照1:2.5(μg/μl)比例混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种11日龄非免疫鹅胚；鹅胚在接种后120h～192h之间死亡，胚体具有典型的GPV感染特征，表现为胚体出血、绒毛尿囊膜水肿的典型特征。拯救出的病毒具有与亲本病毒相近的生物学特性。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组质粒是pLH，它的构建方法为：超速离心浓缩GPVLH株病毒，提取病毒的基因组单链DNA，体外退火后生成双股DNA；选用BclI和NcoI酶切基因组DNA生成亚基因组片段，分别克隆入pBSKN...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建业，凌珏怡，朱国强，黄钰，王志仙，孟霞，朱礼倩，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32