本发明专利技术属于医药工程技术领域，具体涉及一种能在表面展示VEGFR‑2 蛋白的重组T4噬菌体的制备方法。首先构建携带有VEGFR‑2胞外区片段的重组质粒，然后转化大肠杆菌BL21，同时利用溶菌酶缺陷型噬菌体T4 e
【技术实现步骤摘要】
一种展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备方法
本专利技术属于医药工程
，具体涉及一种能在表面展示VEGFR-2蛋白的重组T4噬菌体的制备方法。
技术介绍
恶性肿瘤的生长、侵袭和转移依赖于血管生成。血管生成主要取决于促血管生成因子和抑制血管生成因子之间的平衡与失衡，肿瘤细胞产生促血管生成因子增多和(或)抑制血管生成因子的减少均可以启动肿瘤血管生成过程。目前，已经有超过20个促血管生成因子和300个抑制血管生成因子被发现。促血管生成因子主要包括：血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)和表皮生长因子(EGF)等，而抑制因子主要有血管抑制素(Angiostatin)、内皮抑素(Endostatin)、凝血栓蛋白-1(TSP-1)、血小板因子-4(PF-4)、基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂、生长抑素(Somatostatin)等。VEGF是最重要的促血管生成因子，目前发现的VEGF家族包括六大成员，即VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(PLGF)，都是二聚体糖蛋白。其中，VEGF-A主要影响血管的生成，它是发现最早、研究最深入的VEGF家族成员，而VEGF-C和VEGF-D与淋巴管的形成关系更加密切。许多肿瘤组织和肿瘤细胞株均高表达VEGF，既能通过旁分泌作用于肿瘤血管内皮细胞，促进血管生成，同时又能通过自分泌刺激肿瘤细胞的增殖，从而促进肿瘤的生长、侵袭和转移。VEGF的生物活性主要通过VEGF受体(VEGFR，VascularEndothelialGrowthFactorReceptor，血管内皮细胞生长因子受体)介导，目前已发现3种VEGF受体：VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。其中，VEGFR-3在淋巴系统中表达，而VEGFR-1和VEGFR-2则位于血管内皮细胞上，均属于酪氨酸激酶III型受体，都有7个免疫球蛋白样胞外区、跨膜区和一个含酪氨酸激酶的细胞内功能区。人的VEGFR-2又名激酶插入区受体(KDR)，是VEGF的主要功能受体。由于VEGF/VEGFR-2信号通路在肿瘤血管生成过程中起关键作用，因此阻断该信号通路的策略可以被用于抗肿瘤血管生成。目前主要包括VEGF或VEGFR-2的单克隆抗体、可溶性VEGFR-2受体和小分子酪氨酸激酶抑制剂等。贝伐珠单抗(Bevacizumab)是人源化的VEGF单克隆抗体，2004年2月获美国食品药品管理局(FDA)批准用于结直肠癌的治疗。雷莫罗单抗(Ramucirumab)是完全人源化的VEGFR-2单克隆抗体，2014年4月获FDA批准用于治疗进展期胃癌或胃食管连接部腺癌。T4噬菌体表面展示技术(T4phagedisplay)是1996年建立起来的一种噬菌体展示技术，是利用T4噬菌体衣壳表面上的2个非必需外壳蛋白：小外壳蛋白(SOC)和高抗原性外壳蛋白(HOC)建立起来的蛋白表达展示系统。T4噬菌体基因组很大，可以插入1000~2000氨基酸长度外源蛋白基因，表达分子量很大的蛋白质，并且将表达的外源蛋白以融合蛋白的形式展示在T4噬菌体的表面，并保持相对独立的空间构象和原有的生物活性。而且T4噬菌体是双股DNA噬菌体中唯一能够在体内产生空衣壳的噬菌体，这种缺乏DNA的可以展示外源蛋白的空衣壳，在生物安全性方面具有十分光明的前景。目前主要应用于抗原、抗体库的建立，双重展示肽库的建立，蛋白质相互作用研究，疫苗设计和诊断试剂的研制等方面，其中疫苗研制方面的应用最多，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)疫苗，口蹄疫病毒(FMDV)疫苗，猪瘟病毒(CSFV)疫苗等。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种能够表面展示VEGFR-2蛋白的重组T4噬菌体的制备方法，利用该方法所制备的重组后T4噬菌体，可以用于肿瘤及与血管增生有关的疾病治疗中。本专利技术所提供的技术方案详述如下。一种展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备方法，该方法技术原理为：首先构建携带有VEGFR-2胞外区片段的重组质粒pJKS-VEGFR-2，然后转化大肠杆菌BL21，同时利用溶菌酶缺陷型噬菌体T4e-侵染大肠杆菌BL21，使T4e-噬菌体与pJKS-VEGFR-2发生同源重组，最终获得表面展示VEGFR-2蛋白的重组T4噬菌体；具体制备过程包括如下步骤：（1）设计引物，并对VEGFR-2胞外区基因片段进行PCR扩增，具体为：首先，人工设计含有SalI和NdeI酶切位点的系列引物序列如下：Sal1-Ig1-F：5’-acgcgtcgacatggcctctgtgggtttgcct-3’，Nde1-Ig4-R：5’-cggaattccatatgtgggacattcacaaccagagag-3’，Nde1-Ig5-R：5’-cggaattccatatgacccctgatcacatggaagga-3’，Nde1-Ig6-R：5’-cggaattccatatgtgccatgcgctctaggatgat-3’，Nde1-Ig7-R：5’-cggaattccatatgttccaagttggtcttttcctgg-3’；然后，以小鼠VEGFR-2细胞外片段核酸编码序列为模板，进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测，并回收；以不同引物序列组合进行PCR扩增时，可获得VEGFR-2胞外区不同免疫球蛋白样结构域的基因片段：VEGFR2-1-4、VEGFR2-1-5、VEGFR2-1-6、VEGFR2-1-7；所述VEGFR2-1-4，包含1212bp，具体碱基序列如SEQIDNO.1所示；所述VEGFR2-1-5，包含1590bp，具体碱基序列如SEQIDNO.2所示；所述VEGFR2-1-6，包含1938bp，具体碱基序列如SEQIDNO.3所示；所述VEGFR2-1-7，包含2232bp，具体碱基序列如SEQIDNO.4所示；（2）酶切、连接，构建含有VEGFR-2基因片段的pJKS重组质粒，具体为：对步骤（1）中PCR扩增产物采用SalI和NdeI进行双酶切，并回收酶切产物备用；对pJKS质粒同样采用SalI和NdeI进行双酶切，并回收酶切产物；用T4-DNA连接酶（DNALigationKit）将上述所回收的PCR酶切产物与pJKS质粒的酶切产物进行连接；（3）转化，筛选获得阳性克隆菌株，扩增后，提取阳性重组质粒备用；具体为：将步骤（2）中的连接产物转化DH5α感受态细胞；采用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，并对筛选所获得的阳性菌株进行PCR鉴定；对PCR鉴定正确的阳性克隆菌株进行扩增，并提取质粒备用，所提取的重组质粒分别命名为pJKS-VEGFR2-1-4，pJKS-VEGFR2-1-5，pJKS-VEGFR2-1-6，pJKS-VEGFR2-1-7，统称为pJKS-VEGFR2；（4）将步骤（3）中筛选所得重组正确的质粒pJKS-VEGFR-2转化大肠杆菌BL21，扩增，备用，具体为：将步骤（3）中阳性重组质粒pJKS-VEGFR2-1-4，pJKS-VEGFR2-1-5，pJKS-VEGFR2-1-6，pJK本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种展示VEGFR‑2的重组T4噬菌体的制备方法，其特征在于，具体制备过程包括如下步骤：（1）设计引物，并对VEGFR‑2胞外区基因片段进行PCR扩增， 所述VEGFR‑2胞外区不同免疫球蛋白样结构域的基因片段具体有：VEGFR2‑1‑4、VEGFR2‑1‑5、VEGFR2‑1‑6、VEGFR2‑1‑7所述VEGFR2‑1‑4的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述VEGFR2‑1‑5的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；所述VEGFR2‑1‑6的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；所述VEGFR2‑1‑7的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；（2）酶切、连接，构建含有VEGFR‑2 基因片段的pJKS重组质粒，具体为：对步骤（1）中PCR扩增产物采用SalI 和 NdeI进行双酶切，并回收酶切产物备用；对pJKS 质粒同样采用SalI 和 NdeI进行双酶切，并回收酶切产物；用T4‑DNA连接酶将上述所回收的PCR酶切产物与pJKS 质粒的酶切产物进行连接；（3）转化，筛选获得阳性克隆菌株，扩增后，提取阳性重组质粒备用；具体为：将步骤（2）中的连接产物转化，并进行抗性筛选；对鉴定正确的阳性克隆菌株进行扩增，并提取质粒备用，所提取的重组质粒统称为pJKS‑VEGFR2；（4）将步骤（3）中筛选所得重组正确的质粒pJKS‑VEGFR‑2转化大肠杆菌BL21，并筛选、扩增，备用；（5）噬菌体重组及培养，具体为：取步骤（4）中含有重组质粒的大肠杆菌BL21培养液，接种T4 e...
【技术特征摘要】
1.一种展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备方法，其特征在于，具体制备过程包括如下步骤：（1）设计引物，并对VEGFR-2胞外区基因片段进行PCR扩增，所述VEGFR-2胞外区不同免疫球蛋白样结构域的基因片段具体有：VEGFR2-1-4、VEGFR2-1-5、VEGFR2-1-6、VEGFR2-1-7所述VEGFR2-1-4的碱基序列如SEQIDNO.1所示；所述VEGFR2-1-5的碱基序列如SEQIDNO.2所示；所述VEGFR2-1-6的碱基序列如SEQIDNO.3所示；所述VEGFR2-1-7的碱基序列如SEQIDNO.4所示；（2）酶切、连接，构建含有VEGFR-2基因片段的pJKS重组质粒，具体为：对步骤（1）中PCR扩增产物采用SalI和NdeI进行双酶切，并回收酶切产物备用；对pJKS质粒同样采用SalI和NdeI进行双酶切，并回收酶切产物；用T4-DNA连接酶将上述所回收的PCR酶切产物与pJKS质粒的酶切产物进行连接；（3）转化，筛选获得阳性克隆菌株，扩增后，提取阳性重组质粒备用；具体为：将步骤（2）中的连接产物转化，并进行抗性筛选；对鉴定正确的阳性克隆菌株进行扩增，并提取质粒备用，所提取的重组质粒统称为pJKS-VEGFR2；（4）将步骤（3）中筛选所得重组正确的质粒pJKS-VEGFR-2转化大肠杆菌BL21，并筛选、扩增，备用；（5）噬菌体重组及培养，具体为：取步骤（4）中含有重组质粒的...
【专利技术属性】
技术研发人员：左曙光，任学群，任兆钧，
申请(专利权)人：河南大学淮河医院，
类型：发明
国别省市：河南,41
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