TAL效应子介导的DNA修饰制造技术

本发明专利技术为TAL效应子介导的DNA修饰，本发明专利技术提供涉及基因靶向(例如，用转录激活因子样效应子核酸酶的基因靶向)的材料和方法。

【技术实现步骤摘要】
TAL效应子介导的DNA修饰相关申请的交叉参考本申请要求2009年12月10日提交的美国临时申请序列号61/285,324、2010年6月7日提交的美国临时申请序列号61/352,108和2010年7月22日提交的美国临时申请序列号61/366,685的优先权，所有申请通过引用全文纳入本文。有关联邦资助的研究的声明本专利技术是在国家科学基金会(NationalScienceFoundation)授予的基金号0820831和0504304下由政府资助完成。政府对本专利技术拥有某些权利。
本专利技术涉及基因靶向的方法，尤其是包括使用转录激活因子样(TAL)效应子序列的方法。
技术介绍
通过同源重组修饰染色体的能力(基因靶向)一直是生物学家的奋斗目标。例如，在植物中，基因靶向可有助于了解植物基因功能，为农作物改良提供新的可能。例如，利用基因靶向可进行重排代谢途径所需的遗传手术以产生高价值农作物，包括改变油或糖分布的种子、提高营养品质的食物或对疾病和压力抗性增加的植物。在动物(例如哺乳动物)中，基因靶向可用于治疗疾病。例如，基因靶向可用于对由各种形式突变引起的缺陷基因进行工程校正。这种基因靶向的有效方法难以实现。
技术实现思路
黄单胞菌属(Xanthomonas)中植物病原菌的TAL效应子通过结合宿主DNA和激活效应子特异的宿主基因，在疾病或引发防御中起重要作用(参见例如，Gu等(2005)Nature435:1122；Yang等(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:10503；Kay等(2007)Science318:648；Sugio等(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA104:10720；和等(2007)Science318:645)。特异性取决于不完善的可变效应子数量，通常是34个氨基酸重复(Schornack等(2006)J.PlantPhysiol.163:256)。多态性主要发生在重复位置12和13，本文将其称为重复可变双残基(RVD)。本专利技术部分基于TAL效应子的RVD以直接、线性形式对应于其靶位置的核苷酸，一种RVD对应于一种核苷酸，有一些简并性且没有明显的环境依赖性。这个令人意外的发现代表蛋白-DNA识别的新机制，能针对新靶向特异性TAL效应子进行靶位置预测。如本文所述，这些蛋白可作为靶向的嵌合核酸酶用于研究和生物技术，有助于基因组工程改造中的同源重组(例如添加或提高用于植物中生物燃料或生物可再生物的特征)。这些蛋白还用作例如转录因子，且特别用于需要很高水平特异性的治疗应用，例如(非限制示例)针对病原体(如病毒)的治疗。在一个方面，本专利技术涉及改良细胞遗传物质的方法，所述方法包括(a)提供含靶DNA序列的细胞；和(b)将转录激活因子样(TAL)效应子-DNA修饰酶导入所述细胞，所述TAL效应子-DNA修饰酶包括(i)修饰双链DNA的DNA修饰酶结构域，和(ii)TAL效应子结构域，包括联合结合靶DNA序列中特异性核苷酸序列的多种TAL效应子重复序列，从而所述TAL效应子-DNA修饰酶修饰细胞或其后代中所述特异性核苷酸序列内或相邻的靶DNA。本方法还可包括将含有与至少部分靶DNA序列同源的序列的核酸提供给细胞，从而在所述靶DNA序列和所述核酸之间产生同源重组。所述细胞可为真核细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或原核细胞。所述靶DNA可为染色体DNA。所述导入可包括用编码TAL效应子DNA修饰酶的载体转染细胞、将TAL效应子DNA修饰酶作为蛋白机械注射入细胞、用细菌III型分泌系统将TAL效应子DNA修饰酶作为蛋白递送到细胞，或通过电穿孔将TAL效应子DNA修饰酶作为蛋白导入细胞。所述DNA修饰酶可为内切核酸酶(如II型限制性内切酶如FokI)。结合所述靶DNA中特异性核苷酸序列的TAL效应子结构域可包括10或更多个DNA结合重复序列，且优选15或更多个DNA结合重复序列。各DNA结合重复序列可包括确定所述靶DNA序列中碱基对识别的重复可变双残基(RVD)，其中各DNA结合重复序列负责识别所述靶DNA序列中的一种碱基对，且其中所述RVD包括下述的一种或多种：识别C的HD；识别T的NG；识别A的NI；识别G或A的NN；NS识别A或C或G或T的NS；识别C或T的N*，其中*代表RVD的第二位置中的缺口；识别T的HG；识别T的H*,其中*代表RVD的第二位置中的缺口；识别T的IG；识别G的NK；识别C的HA；识别C的ND；识别C的HI；识别G的HN；识别G的NA；识别G或A的SN；和识别T的YG。各DNA结合重复序列可包括确定所述靶DNA序列中碱基对识别的RVD，其中各DNA结合重复序列负责识别所述靶DNA序列中的一种碱基对，且其中所述RVD包括下述的一种或多种：识别C的HD；识别C的ND；识别C的HI；识别G的HN；识别G的NA；识别G或A的SN；和识别T的YG；和识别G的NK，和下述的一种或多种：识别C的HD；识别T的NG；识别A的NI；识别G或A的NN；NS识别A或C或G或T的NS；识别C或T的N*，其中*代表RVD的第二位置中的缺口；识别T的HG；识别T的H*,其中*代表RVD的第二位置中的缺口；识别T的IG。在另一方面，本专利技术涉及生成编码所选核苷酸序列特异性TAL效应子的核酸的方法，所述方法包括：(1)用PspXI线性化初始质粒，所述初始质粒包括编码第一TAL效应子DNA结合重复结构域的核苷酸序列，所述结构域具有特异于所选核苷酸序列的第一核苷酸的重复可变双残基(RVD)，其中所述第一TAL效应子DNA结合重复结构域在3’末端具有独特的PspXI位点；(2)将编码一种或多种TAL效应子DNA结合重复结构域的DNA模块连接到所述初始质粒的PspXI位点，所述结构域具有特异于所选核苷酸序列的后续核苷酸的RVD，其中所述DNA模块具有XhoI粘性末端；和(3)重复步骤(1)和(2)直到核酸编码出能结合所选核苷酸序列的TAL效应子。连接后，所述方法还可包括确定PspXI位点中DNA模块的方向。所述方法可包括重复步骤(1)和(2)1-30次。在另一方面，本专利技术涉及生成编码转录激活因子样效应子内切核酸酶(TALEN)的核酸的方法，所述方法包括(a)在细胞基因组中鉴定第一核苷酸序列；和(b)合成编码TALEN的核酸，所述核酸包括(i)与所述第一独特核苷酸序列联合结合的多种DNA结合重复序列，和(ii)在所述第一核苷酸序列内或邻近的位置产生双链切割的内切核酸酶，其中各DNA结合重复序列包括确定所述靶DNA中碱基对识别的RVD，其中各DNA结合重复序列负责识别所述靶DNA中的碱基对，其中所述TALEN包括一种或多种下述RVD:识别C的HD；识别T的NG；识别A的NI；识别G或A的NN；NS识别A或C或G或T的NS；识别C或T的N*；识别T的HG；识别T的H*；识别T的IG；识别G的NK；识别C的HA；识别C的ND；识别C的HI；识别G的HN；识别G的NA；识别G或A的SN；和识别T的YG。TALEN包括以下RVD的一种或多种：识别C的HD；识别C的ND；识别C的HI；识别G的HN；识别G的NA；识别G或A的SN；和识别T的YG；和识别G的NK，和下述的一种或多种：识别C的H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码序列特异性内切核酸酶的重组核酸表达载体，包括连接来自核酸酶的核苷酸序列的序列特异性TAL效应子的核苷酸序列，其可操作性连接至启动子序列。

【技术特征摘要】
2009.12.10 US 61/285,324;2010.06.07 US 61/352,108;1.一种编码序列特异性内切核酸酶的重组核酸表达载体，包括连接来自核酸酶的核苷酸序列的序列特异性TAL效应子的核苷酸序列，其可操作性连接至启动子序列。2.如权利要求1所述的重组核酸表达载体，其中所述核酸酶是HhaI、HindIII、NotI、BbvCI、EcoRI、BglI、和AlwI或II型内切核酸酶例如FokI。3.如权利要求1所述的重组核酸表达载体，其中所述序列特异性TAL效应子的核苷酸序列编码在位置12和13处具有高度可变残基的许多串联重复，其可识别并结合特异DNA序列。4.如权利要求3所述的重组核酸表达载体，其中所述重复是34氨基酸重复，选自AvrBs3的中央区域(SEQIDNO.3)。5.如权利要求1-4中任一项所述的重组核酸表达载体，其中所述序列特异性TAL效应子的核苷酸序列通过将合适的重复顺序引入Gateway-ready高拷贝细菌克隆载体中来...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·F·沃塔斯，A·波格丹诺维，张峰，M·克里斯蒂安，T·瑟马克，C·L·施米特，E·多伊尔，王俐，
申请(专利权)人：明尼苏达大学董事会，衣阿华州立大学研究基金会股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US