同时识别1型和3型鸭甲型肝炎病毒的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种同时识别1型和3型鸭甲型肝炎病毒的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用，该杂交瘤细胞株稳定性好，经过体外传代以及细胞冻存复苏仍能稳定分泌单克隆抗体，所分泌的单克隆抗体可以同时识别1型和3型鸭甲型肝炎病毒，与1型鸭甲型肝炎病毒的亲和常数在10

【技术实现步骤摘要】
同时识别1型和3型鸭甲型肝炎病毒的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用
本专利技术涉及一种单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株、以及该单克隆抗体的用途。
技术介绍
鸭甲型肝炎病毒(DHAV)可引起雏鸭发生急性、高度致死性传染病，主要感染4周龄以下的雏鸭，其中1周龄以内的雏鸭死亡率高达95％，主要特征病变为患病鸭的肝脏肿大和出血。根据基因组特征和抗原中和试验，将鸭甲型肝炎病毒分为3个基因型或血清型，即鸭甲型肝炎病毒1型(DHAV-1)、2型(DHAV-2)和3型(DHAV-3)。其中鸭甲型肝炎病毒1型与2型不产生交叉保护作用，与3型有部分交叉中和反应。目前我国养鸭生产中均有1型和3型鸭甲型肝炎的发生和流行，但寻找1型和3型鸭甲型肝炎病毒的共同抗体并建立能同时检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒的简便快速检测方法一直是学术界和生产中没有很好解决的难题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于研制既能识别1型鸭甲型肝炎病毒、也能识别3型鸭甲型肝炎病毒的单克隆抗体，从而为临床和基层单位不漏检1型或3型鸭甲型肝炎病毒提供广谱、特异性强、亲和力高的检测抗体。为实现上述专利技术目的，经研究，本专利技术提供如下技术方案：1.杂交瘤细胞株DHAV-MAb1，保藏编号为CCTCCNO：C201701。2.由杂交瘤细胞株DHAV-MAb1分泌的单克隆抗体。3.所述单克隆抗体在制备单独检测1型或3型鸭甲型肝炎病毒以及同时检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒的试剂中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术以纯化的1型鸭甲型肝炎病毒作为免疫原及筛选抗原，通过单克隆抗体技术筛选出了能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经实验证实，该杂交瘤细胞株稳定性好，经过体外传代以及细胞冻存复苏仍能稳定分泌单克隆抗体；所分泌的单克隆抗体可以同时识别1型和3型鸭甲型肝炎病毒，与1型鸭甲型肝炎病毒的亲和常数在109数量级以上，且不与鸭病毒性肠炎病毒、鸭乙肝病毒、鸭坦布苏病毒、小鹅瘟病毒、鸭疫里默氏杆菌、鸭大肠杆菌和鸭沙门氏菌发生特异性反应，从而为临床和基层单位不漏检1型或3型鸭甲型肝炎病毒提供了广谱、特异性强、亲和力高的检测抗体，可用于制备单独检测1型或3型鸭甲型肝炎病毒以及同时检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒的试剂。生物材料保藏杂交瘤细胞株DHAV-MAb1于2017年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏编号为CCTCCNO：C201701。附图说明图1为免疫小鼠脾细胞、SP2/0小鼠骨髓瘤细胞及饲养细胞的形态，其中a为免疫小鼠脾细胞，b为培养24h的饲养细胞，c为培养7d的饲养细胞，d为SP2/0小鼠骨髓瘤细胞。图2为融合后的杂交瘤细胞，其中1为培养5d后的杂交瘤细胞；2为培养9d后的杂交瘤细胞。图3为纯化腹水的SDS-PAGE分析，其中M为蛋白Marker，1为杂交瘤细胞株DHAV-MAb1的纯化腹水。图4为单克隆抗体的亲和力常数测定。图5为胶体金颗粒与金标单克隆抗体的紫外光谱。图6为胶体金试纸条的组装示意图。图7为胶体金试纸条的兔抗1型鸭甲型肝炎病毒多抗包被浓度优化，1-6分别为多抗浓度0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL和1.6mg/mL。图8为胶体金试纸条的羊抗鼠IgG包被浓度优化，1-6分别为羊抗鼠IgG浓度0.2mg/mL、0.6mg/mL、1.0mg/mL、1.4mg/mL、1.8mg/mL和2.0mg/mL，7为阴性。图9为胶体金试纸条的金标单克隆抗体包被浓度优化，1-8分别为1mL金标单克隆抗体溶液离心后的沉淀用100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL和450μL金标抗体重悬液稀释。图10为胶体金试纸条检测1型鸭甲型肝炎病毒的灵敏度试验结果，1-9分别为阳性鸭胚尿囊液(0.6mg/mL)按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128和1:256稀释，10为阴性对照。图11为胶体金试纸条检测3型鸭甲型肝炎病毒的灵敏度试验结果，1-7分别为阳性鸭胚尿囊液(0.3mg/mL)按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32和1:64稀释，8为阴性对照。图12为胶体金试纸条检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒的特异性试验结果，1-5和7分别为3型鸭甲型肝炎病毒CZ160312株、QL株、QL13株、MY02株、YA151006株和SD151227株，6和8-10分别为1型鸭甲型肝炎病毒BZB株、CD1231株、DY0903株和X株，11为阴性对照。图13为胶体金试纸条检测鸭常见的其它致病病原的特异性试验结果。图14为胶体金试纸条检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒的重复性试验结果，1-3分别为第1、2、3批次的胶体金试纸条，a为检测1型鸭甲型肝炎病毒；b为检测3型鸭甲型肝炎病。图15为胶体金试纸条的稳定性试验结果，1-3分别为保存1、2、3个月。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将结合附图对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中使用的主要材料如下：1、细胞、菌株与毒株SP2/0小鼠骨髓瘤细胞购自中国科学院细胞库；1型鸭甲型肝炎病毒(BZB株、CD1231株、DY0903株和X株)、3型鸭甲型肝炎病毒(CZ160312株、QL株、QL13株、MY02株、YA151006株和SD151227株)、鸭病毒性肠炎病毒(DPVCHv株)、鸭乙肝病毒(DHBV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、小鹅瘟病毒(GPV)、鸭大肠杆菌(E.coli,保藏号：CVCC83003)、鸭沙门氏菌(SE,保藏号：CMCC50083)、鸭疫里默氏杆菌(RACH-1株)均由四川农业大学禽病防治研究中心保存提供。2、试验动物6-8周龄和10-12周龄SPFBALB/c雌性小鼠购自成都达硕实验动物有限公司；10日龄鸭胚购自四川农业大学农场。3、试剂与材料HAT培养基添加剂(50×)、聚乙二醇(PEG1450)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均为Sigma公司产品；胎牛血清(FBS)和RPMI1640培养基为Gibco公司产品；牛血清白蛋白(BSA)为BIOSHARP公司产品；鼠单克隆抗体Ig类亚类鉴定酶标二抗套装购自北京博奥龙免疫技术有限公司；一次性细胞瓶、细胞培养板和ELISA酶标板购自美国Corning公司。兔抗1型鸭甲型肝炎病毒多抗由四川农业大学禽病防治研究中心保存提供；20nm胶体金溶液、玻璃纤维素膜(MA0280、GL0194)、硝酸纤维素(NC)膜(SartoriusCN140，SartoriusCN95，vivid170和Millipore135)、样品垫(GL-b03和GL-b04)、吸收垫(H5072)、底板(DB-6)、白色塑料卡(A-9)和衔接胶带均购自上海杰一生物技术有限公司；玻璃纤维素膜(CB-0801、SB06、VL78)购自上海金标生物科技有限公司。4、仪器设备超纯水仪(WaterPro，美国Labconco公司)；核酸蛋白检测仪(SmartSpec3000，美国Bio-rad公司)；凝胶成相系统(GelDoc3000，美国Bio-rad公司)；倒置本文档来自技高网...

【技术保护点】
杂交瘤细胞株DHAV‑MAb1，保藏编号为CCTCC NO：C201701。

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株DHAV-MAb1，保藏编号为CCTCCNO：C201701。2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株DHAV-MAb1分泌...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪铭书，程安春，杨旸，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51