【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因重组及疫苗，具体涉及一种表达pcv2 cap蛋白的重组伪狂犬病毒及制备方法和应用。
技术介绍
1、猪圆环病毒2型（pcv2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征，皮炎与肾病综合征的主要病原；其主要侵害2～8周龄的断奶仔猪，死亡率高达50%及以上，常给养猪业带来巨大的经济损失。cap蛋白是pcv2的主要免疫原蛋白，含有主要保护性抗原表位，是制备pcv2疫苗的理想靶抗原。
2、伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，prv）属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科水痘病毒属。是一种双链dna病毒，基因组大小约为150 kb。prv基因组包含有许多非必需基因，其多个非必需基因可以被编码异源抗原的基因所取代，被异源基因取代后的病毒也能够正常复制，不会受到影响。因此，常以prv作为重组毒株的病毒载体。
3、目前，多通过接种bartha-k61疫苗来进行猪群伪狂犬病的防控，但是bartha-k61疫苗在猪群体中的免疫力偏低，免疫过bartha-k61疫苗的猪场仍常出现prv严重感染的问题，因此bartha-k61疫苗并不能为猪群提供完全有效的保护，仍需进一步研究改善。
4、临床上，pcv2和prv常出现混合感染的情况，因此研发一种能同时且有效防控pcv2和prv这两种病毒的疫苗变得尤为重要。
技术实现思路
1、为解决上述现有技术问题，本专利技术提供了一种表达pcv2 cap蛋白的重组伪狂犬病毒及制备方法和应用，以prv fj01为病毒载体构建了tk
2、为实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、重组转移载体，所述重组转移载体包括：
4、转移载体puc19-tk/cap，所述puc19-tk/cap包括以伪狂犬变异株tk基因两端序列所作的同源臂和经人工修饰的cap基因；
5、转移载体puc19-gi/ge/cap，所述puc19-gi/ge/cap包括以伪狂犬变异株gi基因上游序列和ge基因下游序列所作的同源臂和经人工修饰的cap基因；
6、其中，经人工修饰的所述cap基因的序列如seq id no.25所示。
7、如以上所述的重组转移载体的制备方法，包括所述puc19-tk/cap的制备方法和所述puc19-gi/ge/cap的制备方法；
8、（1）所述puc19-tk/cap的制备方法包括以下步骤：
9、步骤s101，以所述伪狂犬变异株tk基因两端序列作为同源臂，采用如seq id no.1和seq id no.2所示的引物进行pcr扩增，获得tk-right片段；
10、步骤s102，经酶切处理和同源重组酶处理，将所述tk-right片段连接至puc19载体上，获得puc19-tkr载体；
11、步骤s103，以pegfp-c3载体为模板，采用如seq id no.3和seq id no.4所示的引物进行pcr扩增，获得tk-egfp片段；
12、步骤s104，将所述tk-egfp片段连接至所述puc19-tkr载体上，获得puc19-tkr-egfp载体；
13、步骤s105，以所述伪狂犬变异株tk基因两端序列作为同源臂，采用如seq id no.5和seq id no.6所示的引物进行pcr扩增，获得tk-left片段；
14、步骤s106，将所述tk-left片段连接至所述puc19-tkr-egfp载体上，获得puc19-tk/egfp载体；
15、步骤s107，将所述puc19-tk/egfp载体进行双酶切处理，将荧光标签egfp替换为人工修饰的所述cap基因片段，构建出puc19-tk/cap转移载体；
16、（2）所述puc19-gi/ge/cap的制备方法包括以下步骤：
17、步骤s201，以所述伪狂犬变异株基因组为模板，分别采用如seq id no.7~8和seqid no.9~10所示的引物进行pcr扩增，分别获得gige-left片段和gige-right片段；
18、步骤s202，以pegfp-c3载体为模板，采用如seq id no.11和seq id no.12所示的引物进行pcr扩增，获得gige-egfp片段；
19、步骤s203，将所述gige-left、gige-egfp和gige-right片段经overlap pcr依次连接，构成gil-cmv-egfp-ger片段；
20、步骤s204，将puc19载体进行双酶切处理，与所述gil-cmv-egfp-ger片段进行连接，获得puc19-gi/ge/egfp载体；
21、步骤s205，将所述puc19-gi/ge/egfp载体进行双酶切处理，将荧光标签egfp替换为人工修饰的所述cap基因片段，构建出puc19-gi/ge/cap转移载体。
22、一种表达pcv2 cap蛋白的重组伪狂犬病毒，所述重组伪狂犬病毒被命名为prvtk-/gi-/ge-/2cap+，所述prv tk-/gi-/ge-/2cap+由以上任一项所述的转移载体puc19-tk/cap和puc19-gi/ge/cap制备得到。
23、进一步地，所述重组伪狂犬病毒prv tk-/gi-/ge-/2cap+以缺失tk、gi和ge三基因的伪狂犬变异株为病毒载体，所述伪狂犬变异株为prv fj01株。
24、进一步地，所述重组伪狂犬病毒prv tk-/gi-/ge-/2cap+，在所述prv fj01株的原tk基因位点处嵌合一个cap基因，并在原gi和ge基因位点处嵌合一个cap基因。
25、如以上任一项所述的表达pcv2 cap蛋白的重组伪狂犬病毒的制备方法，包括以下步骤：
26、步骤s301，利用第一敲除质粒将所述伪狂犬变异株中的tk基因敲除并替换为荧光标签egfp，构建出prv tk-/egfp+毒株；
27、步骤s302，利用第三敲除质粒和puc19-tk/cap转移载体，将所述prv tk-/egfp+毒株中的荧光标签egfp替换为cap基因，构建出prv tk-/cap+毒株；
28、步骤s303，利用第二敲除质粒将所述prv tk-/cap+毒株中的gi、ge基因敲除并替换为荧光标签egfp，构建出prv tk-/gi-/ge-/cap+/egfp+毒株；
29、步骤s304，利用第三敲除质粒和puc19-gi/ge/cap转移载体，将所述prv tk-/gi-/ge-/cap+/egfp+毒株中的荧光标签egfp替换为cap基因，构建出prv tk-/gi-/ge-/2cap+重组病毒。
30、进一步地，还本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.重组转移载体，其特征在于，所述重组转移载体包括：
2.如权利要求1所述的重组转移载体的制备方法，其特征在于，包括所述pUC19-TK/Cap的制备方法和所述pUC19-gI/gE/Cap的制备方法；
3.一种表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒被命名为PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+，所述PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+由权利要求1至2任一项所述的转移载体pUC19-TK/Cap和pUC19-gI/gE/Cap制备得到。
4.根据权利要求3所述的表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+以缺失TK、gI和gE三基因的伪狂犬变异株为病毒载体，所述伪狂犬变异株为PRV FJ01株。
5.根据权利要求4所述的表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+，在所述PRV FJ01株的原TK基因位点处嵌合一个Cap基因，并在原gI和gE基因位点处
6.如权利要求3至5任一项所述的表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的制备方法，其特征在于，还包括所述第一敲除质粒、第二敲除质粒和第三敲除质粒的制备，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的表达PCV2 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的制备方法，其特征在于：
9.一种疫苗组合物，其特征在于，包含如权利要求3至8任一项所述的重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+。
10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒PRV TK-/gI-/gE-/2Cap+的抗原含量为≥104.0TCID50/头份。
...【技术特征摘要】
1.重组转移载体，其特征在于，所述重组转移载体包括：
2.如权利要求1所述的重组转移载体的制备方法，其特征在于，包括所述puc19-tk/cap的制备方法和所述puc19-gi/ge/cap的制备方法；
3.一种表达pcv2 cap蛋白的重组伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒被命名为prv tk-/gi-/ge-/2cap+，所述prv tk-/gi-/ge-/2cap+由权利要求1至2任一项所述的转移载体puc19-tk/cap和puc19-gi/ge/cap制备得到。
4.根据权利要求3所述的表达pcv2 cap蛋白的重组伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒prv tk-/gi-/ge-/2cap+以缺失tk、gi和ge三基因的伪狂犬变异株为病毒载体，所述伪狂犬变异株为prv fj01株。
5.根据权利要求4所述的表达pcv2 cap蛋白的重组伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病...
【专利技术属性】
技术研发人员：颜其贵，彭茜翎，张白玉，严新语，赵珊，史纪强，胡洹圆，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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