【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种pedv疫苗，具体涉及一种pedv重组腺相关病毒载体疫苗制备及应用。
技术介绍
1、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)，属冠状病毒科，α冠状病毒属成员，为有囊膜的单股正链rna病毒，病毒粒子呈多形性，直径约95～190nm。该病毒基因组全长约28kb，编码纤突糖蛋白(s)、囊膜蛋白(e)、基质蛋白(m)和核蛋白(n)等4个结构蛋白；多聚蛋白复合体pp1a和pp1ab两个非结构蛋白；以及1个orf3辅助蛋白。s蛋白是位于病毒囊膜表面的i型膜糖蛋白，由n端信号肽、胞外区、单跨膜结构域和短的细胞质尾组成。该蛋白基本结构可分为s1(1～726aa)和s2(727～1386aa)两个亚基。s蛋白n端s1亚基是受体结合结构域所在部位。病毒侵入过程中，s1亚基能够与细胞表面糖蛋白受体结合，介导s2亚基与细胞膜融合。该过程在病毒感染中发挥重要作用，是病毒感染的启始。由于s蛋白是pedv表面重要结构蛋白，也是机体免疫细胞识别的重要目标。因此，其诱导产生的中和抗体能与s蛋白相关抗原表位结合，使病毒无法与细胞受体结合，从而阻断病毒感染。通过将pedv s蛋白基因进行遗传进化分析，可将pedv分为传统pedv毒株和新型变异pedv毒株，新型变异pedv毒株又分为s non-indel型和s indel型2个亚群。在生产中，s non-indel型野毒株导致的病死率通常更高。s non-indel型毒株是近年来流行的优势毒株，其基因变异较快，并引起抗原表位发生变化，是导致当前商品
2、腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)是一种细小病毒科，无包膜、复制缺陷型病毒。病毒直径约25nm，形态呈二十面体状。该病毒基因组为线性单链dna，全长约4.7kb，由两端的反向末端重复序列(itr)以及中间含有rep基因和cap基因的两个开放阅读框(orf)组成。该病毒本身无法复制，需在腺病毒(adv)、疱疹病毒(hsv)、人乳头状瘤病毒和牛痘病毒的辅助下完成复制。重组腺相关病毒(raav)是将野生型aav的编码基因(主要是cap基因和rep基因)用外源基因表达原件替换改造成的新型病毒型基因递送载体。依据该病毒载体制备的重组病毒具有感染细胞类型广；免疫原性低，对机体无不良反应；能够长时稳定表达目的基因等优势。已成为当今成熟且应用较为广泛的病毒型基因递送载体，广泛应用于基因编辑、基因治疗、疫苗开发等领域。
3、自2010年以来，pedv毒株不断变异，表现出免疫逃逸力增强、变异速度加快、致病力增强等特点，给生猪养殖和疫情防控带来巨大挑战。开发安全有效的抗pedv疫苗成为当务之急。现有文献1(专利公开号：cn116510002a)公开了一种猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗及其制备方法，从养殖场分离得到一株pedv-wn株强毒毒株，将株pedv-wn株作为原始毒株进行传代致弱，选取的f130代毒株进行保种，得到pedv-kb-4-r株弱毒疫苗。但是文献1的弱毒疫苗冷冻保存和运输成本较高，以及pedv为rna病毒，致弱毒株基因突变易导致毒力反强。现有文献2(专利公开号：cn114591920a)公开了猪流行性腹泻病毒毒株、灭活疫苗及其应用，猪流行性腹泻病毒pedv-ch/gm2018株于2018年从山东省高密市pedv阳性猪场病猪肠道采集分离所得，随后细胞扩培该毒株，并收获病毒液；将病毒液加入灭活剂中灭活，并与佐剂混合，乳化后即得灭活疫苗。但是文献2的病毒被灭活后不能在体内复制，需多次大剂量注射，才能达到免疫保护；灭活疫苗多次大剂量注射容易引起猪应激；以及免疫途径单一，仅能诱导体液免疫。此外，文献1～2还存在的问题有：pedv野毒株变异较快，不易适应体外连续传代培养，限制了灭活疫苗批量生产；pedv野毒株变异较快，毒株之间的交叉保护力较弱。因此，现有的弱毒疫苗和灭活疫苗无法完全保护猪群免受变异毒株感染，且pedv野毒株体外适应能力较弱，无法利用其大规模制备弱毒疫苗和灭活疫苗。目前生产中急需安全、有效、保护力全，且开发周期较短的pedv疫苗。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种pedv重组腺相关病毒载体疫苗制备及应用，解决了针对传统毒株开发的弱毒疫苗和灭活疫苗无法完全保护猪群免受变异毒株感染，且pedv野毒株体外适应能力较弱，无法利用其大规模制备弱毒疫苗和灭活疫苗的问题。
2、为了达到上述目的，本专利技术提供了一种pedv重组腺相关病毒的制备方法，该方法包含：
3、(1)根据pedv s1基因设计能扩增全长pedv s1基因的特异性上引物和特异性下引物，并在特异性上引物和特异性下引物的上下游5’端分别添加酶切位点bamhi和hindiii；所述特异性上引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述特异性下引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；
4、(2)以含有pedv s1基因的t载体质粒为模板，使用所述特异性上引物和所述特异性下引物，经pcr扩增pedv s1基因全长序列(优化后序列)；pcr扩增结束后，经琼脂糖凝胶电泳分析，进行胶回收，得到pedv s1回收产物；pedv s1 cdna的核苷酸序列如seq id no.7所示(在pedv s1原序列5’端和3’端分别添加atg和taa起始密码子)
5、(3)将核苷酸序列如seq id no.8所示的paav-cmv载体质粒和pedv s1回收产物分别按照酶切体系加样并混匀，置于37℃，酶切hindⅲ；后置于30℃，酶切bamhⅰ；酶切产物经琼脂糖凝胶进行电泳检测，进行胶回收，将回收的paav-cmv载体与pedv s1基因按照连接体系，16℃连接，构成raav-cmv-pedv s1骨架质粒；
6、(4)将hek293t细胞接种至细胞瓶内，并添加含10％血清的dmem培养基，置于37℃、5％co2培养箱内培养，当hek293t细胞汇合度达到60～70％时，进行转染；转染前，吸弃原有培养基，用pbs润洗hek293t细胞，添加medium培养基培养；
7、(5)在2支离心管中均加入medium无血清的培养基，在其中1支管中各加入lipo293tm脂质体转染试剂，轻轻混匀；在另1支管中加入raav-cmv-pedv s1骨架质粒、paav-rc和paav-helper质粒，混匀；将其中1支管中内转染试剂和培养基加至另1支管内，并轻轻混匀，室温静置，添加至细胞培养瓶中，继续培养；
8、(6)吸弃原有培养基，换成含1％胎牛血清的dmem培养液，继续培养；转染后，收集培养液于离心，取上清；在细胞瓶内添加pbs混匀，并置于-80℃反复冻融3次；收集细胞培养瓶内细胞悬液离心，取上清，将取得的所有上清过滤除菌，超滤浓缩。
9、优选地，在步骤(2)中，所述pcr扩增的程序为95℃5min、95℃30s、60℃30s、72℃10s、35个循环、72℃延伸和4℃恒温保存。...
【技术保护点】
1.一种PEDV重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，该方法包含：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述PCR扩增的程序为95℃5min、95℃30s、60℃30s、72℃10s、35个循环、72℃延伸和4℃恒温保存。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述酶切体系含有Buffer、HindⅢ限制性内切酶、BamHⅠ限制性内切酶、pET-28a(+)载体质粒和ddH2O；所述连接体系含有T4 ligase Buffer、T4连接酶、Pet-28a(+)、目的基因DNA片段、ddH2O。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述添加Medium培养基培养的时间为2h；在步骤(5)中，所述继续培养的时间为24h；在步骤(6)中，所述继续培养的时间为5d。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述过滤除菌是使用0.22μm细菌滤器进行的；所述超滤浓缩是经100kDa超滤管进行的。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的制
7.根据权利要求6所述的的PEDV重组腺相关病毒，其特征在于，该病毒中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的PEDV S1基因。
8.根据权利要求6所述的的PEDV重组腺相关病毒，其特征在于，该病毒中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的rAAV-CMV-PEDV S1骨架质粒。
9.一种如权利要求6所述的PEDV重组腺相关病毒在制备检测PEDV野毒株的试剂中的应用。
10.一种如权利要求6所述的PEDV重组腺相关病毒在制备治疗PEDV野毒株的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种pedv重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，该方法包含：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述pcr扩增的程序为95℃5min、95℃30s、60℃30s、72℃10s、35个循环、72℃延伸和4℃恒温保存。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述酶切体系含有buffer、hindⅲ限制性内切酶、bamhⅰ限制性内切酶、pet-28a(+)载体质粒和ddh2o；所述连接体系含有t4 ligase buffer、t4连接酶、pet-28a(+)、目的基因dna片段、ddh2o。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述添加medium培养基培养的时间为2h；在步骤(5)中，所述继续培养的时间为24h；在步骤(6)中，所述继续培养的时间为5d。...
【专利技术属性】
技术研发人员：王印，庞茂楠，任梅渗，江地科，李颜炜，涂藤，杨悦，周游，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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