本发明专利技术涉及一种鸭肝炎Ⅰ型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，具体涉及一种通过鸭肝炎Ⅰ型病毒抗原致敏双醛化绵羊红细胞制备间接血凝诊断抗原的方法。本发明专利技术的方法生产的鸭肝炎Ⅰ型病毒间接血凝诊断抗原保存时间长，可达半年；而且缩短了诊断时间，仅需要半个小时，使用方便简单，适于在实际生产中的推广与应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，具体涉及 一种通过鸭肝炎I型病毒抗原致敏双醛化绵羊红细胞制备间接血凝诊断抗原的 方法。
技术介绍
鸭病毒性肝炎又称鸭肝炎，俗称"背脖病"，主要发生于三周龄以下雏鸭， 是一种传播迅速、高度致死性的传染病，该病可由三种不同的病原引起，分别称为DHV- I 、 DHV-II禾B DHV-III型；3个血清型之间无交叉保护性。其中DHV-I主要侵害4周龄以内的雏鸭。特别是不足1周龄的雏鸭最易感染，死亡率可 达90%以上，且其引起的鸭病毒肝炎呈世界性分布，是危害养鸭业最为严重的 传染病之一。我国流行的主要为I型鸭病毒肝炎。1998年至1999年间，程安春 在我国首次发现有II型DHV的存在。随着集约化养殖水平的提高，该病的流行 趋势在增强，因而建立快速、灵敏和特异的血清学诊断方法势在必行。目前，鸭病毒肝炎检测技术主要有病毒分离技术和血清学检测技术等。中 和试验是检测鸭病毒肝炎的经典方法。该法检测结果准确可靠，是目前公认的 一种权威方法。但其繁琐、费时、成本高，不能用于快速检测，不适于基层的 推广应用。近年来，间接血凝试验(IHA)经过不断改进后己广泛应用于检测血 清中各种病原的抗体，与ELISA相比，间接血凝试验操作过程简便、节省时间， 且不需要特殊仪器。本研究采用DHV- I抗原致敏双醛化绵羊红细胞，且对间接血凝诊断抗原工 艺进行优化，旨在建立一种简便、稳定、敏感、特异性强、保存期长的用于检 测鸭病毒性肝炎流行病学调査及抗体水平检测的方法。
技术实现思路
本专利技术的要解决的技术问题在于提出一种鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断 抗原的制备方法。本专利技术的要解决的又一技术问题在于提出一种诊断鸭肝炎I型病毒的试剂品-O本专利技术要解决上述技术问题所采用的技术方案为本专利技术的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，包括以下步骤1、 双醛化绵羊红细胞的制备取质量百分比浓度为8%绵羊红细胞悬液1重量份，边搅拌边滴加质量百分 浓度为3%丙酮醛1重量份，24 26。C搅拌15 18小时，3000r/min离心15 20 分钟，弃上清，红细胞用PBS溶液洗涤，用PBS溶液配制成质量百分比浓度 为8%的红细胞悬液；取上述红细胞悬液1重量份，边搅拌边滴加质量百分浓度比为3%甲醛溶液 l重量份，24 26。C搅拌15 18小时，3000r/min离心15 20分钟，取红细胞 用PBS溶液洗涤，用PBS溶液配制成质量百分比含量为8。/。的红细胞悬液，添 加质量百分比浓度为0.2%的叠氮钠；2、 双醛化红细胞的鞣酸化取质量百分比含量为8%的双醛化红细胞40毫升，用pH7.0， 0.01mol/L PBS溶液洗涤，加入体积为质量百分比含量为8%的双醛化红细胞溶液的5 倍的pH7.0， 0.01mol/LPBS溶液，混匀后搅拌，加热至37。C，加入体积为质 量百分比含量为8%的双醛化红细胞溶液1.25倍的质量体积比为0.01%的鞣 酸溶液，全部加完后搅拌30 60分钟，离心，弃上清，红细胞泥用O. 15mo1/ L， pH6.4的PBS洗涤，离心后在沉淀物内加入体积为质量百分比含量为8% 的双醛化红细胞溶液的3.925倍的0.15 mol/L， pH6.4的PBS即为2%的双醛 化鞣酸化红细胞；3、鸭肝炎I型病毒抗原致敏双醛化鞣酸化绵羊红细胞将鸭肝炎I型病毒抗原贮存液用0.15mo1/ L、 pH为6.4的PBS溶液稀释10 倍，将稀释后的鸭肝炎I型病毒抗原溶液加入2倍体积的质量百分比浓度为 8%双醛化鞣酸化红细胞悬液，充分混合，37。C水浴致敏60 90分钟， 1500r/min离心10 15分钟，沉淀加3倍体积的质量百分比浓度为0.25%的血清 白蛋白悬浮，37'C水浴30 60分钟，1500r/min离心10 15分钟，沉淀用 0.15mol/L、 pH为6.4的PBS溶液洗涤，加入体积为鸭肝炎I型病毒抗原贮存 液160倍的0.01mol/L、 pH为7.0的PBS溶液，即成鸭肝炎I型病毒间接血凝诊 断抗原。在步骤(l)中绵羊红细胞悬液的制备方法为在1重量份的健康青年公绵羊 血中加入阿氏液1 1.2重量份，混匀，1 4。C存放3 5d后过滤；过滤后的血 液每重量份中加入生理盐水9重量份，混匀，1000r/min离心10 15分钟，取红 细胞加入9倍重量的生理盐水洗涤4 6次，用含有质量百分比含量为0.85%氯 化钠、pH值为7.2的PBS配成重量百分比为8%红细胞悬液。其中，在本专利技术方法的步骤(1)中采用的PBS溶液为含氯化钠质量百分比含 量0.85%、 pH值为7.2的PBS溶液；在步骤(1)中加入丙酮醛溶液后25'C搅拌优选 16小时，加入甲醛溶液后25'C搅拌优选16小时。在本专利技术方法的步骤(2)中鞣酸采用pH7.0， 0.01mol/L的PBS溶液配制。在本专利技术方法的步骤(3)中鸭肝炎I型病毒抗原贮存液的制备方法为将疑 似鸭病毒性肝炎病例中分离到的病变肝组织制成悬液接种于易感雏鸭，接种后 24 48h后易感雏鸭死亡，且具有鸭病毒性肝炎的典型临床症状和体征、病理变 化，再从死亡雏鸭组织中分离病毒，制成悬液接种12日龄鸭胚后4天取尿囊液， 离心，浓縮提纯后通过电镜检测看到病毒颗粒，呈类晶格状排列，颗粒近似圆 形，直径在35 40nm，即得鸭肝炎I型病毒溶液，并测定鸭胚半数致死量。取 对10日龄鸭胚的半数致死量为10"/0.2ml的鸭肝炎I型病毒溶液，加入体积比为 鸭肝炎I型病毒溶液O. P/。的质量百分比含量为37。/。的甲醛溶液37。C灭活24小时，透析，待鸭肝炎I型病毒抗原溶液的体积浓縮为原体积的l/5时，即为鸭肝炎I型病毒抗原ie存液。其中，透析优选聚乙二醇-ioooo的透析袋。在鞣酸化之前对双醛化绵羊红细胞进行自凝性检测，其方法为在血凝板上任选3 L，分别滴入0.01mol/LpH7.0PBS溶液、4倍稀释的鸭肝炎I型病毒阴性 血清和鸭肝炎I型病毒阳性血清各50tx 1;取双醛化鞣酸化的绵羊红细胞0.1ml 加0.01mol/L和pH7.0的PBS溶液0.9ml混匀，在上述三个孔中分别滴加25 U 1，混 匀，盖上玻片室温下放置2h观察红细胞是否凝集。本专利技术还提供了一种鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断的试剂盒，包括(1) 鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原血凝抗原；(2) 稀释液0.01mol/L， pH7.0的PBS溶液;(3) 阳性对照鸭肝炎I型病毒抗原贮存液；(4) 说明书和96孔板。本专利技术的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断的试剂盒的使用方法为在96孔板 上每孔加O.Ol mol/L， pH7.0的PBS溶液25uL，加入25ul血清样本于第一孔中，吸 吹混匀，取出25ul加于第二孔中，如此连续稀释至第ll孔，混合后弃掉25ul，最 后一孔不加血清样本作为阴性对照；每一血清样本按同法稀释两排，每一样本 的第一排滴加制备的DHV- I间接血凝诊断抗原25ul，第二排的最后一孔不加血 清样本，加阳性对照25ul;将反应板置室温放置30分钟，待空白对照孔红血球全 部沉于孔底，即可判定结果。本专利技术通过采用了双醛化和鞣酸化绵羊红细胞和PBS缓冲液的浓度和pH 值的调节，所具有的有益效果为1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸭肝炎Ｉ型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，包括以下步骤： （１）双醛化绵羊红细胞的制备： 取质量百分比浓度为８％绵羊红细胞悬液１重量份，边搅拌边滴加质量百分浓度为３％丙酮醛１重量份，２４～２６℃搅拌反应１５～１８小时，３００ ０ｒ／ｍｉｎ离心１５～２０分钟，弃上清，红细胞用ＰＢＳ溶液洗涤，用ＰＢＳ溶液配制成质量百分比浓度为８％的红细胞悬液； 取上述红细胞悬液１重量份，边搅拌边滴加质量百分浓度比为３％甲醛溶液１重量份，２４～２６℃搅拌１５～１８小时，３０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５～２０分钟，取红细胞用ＰＢＳ溶液洗涤，用ＰＢＳ溶液配制成质量百分比含量为８％的红细胞悬液，每１００毫升质量百分比含量为８％的红细胞悬液中添加０．２克的叠氮钠； （２）双醛化红细胞的鞣酸化 取质量百分比含量为８％ 的双醛化红细胞４０毫升，用ｐＨ７．０，０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ溶液洗涤，加入体积为质量百分比含量为８％的双醛化红细胞溶液的５倍的ｐＨ７．０，０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ溶液，混匀后搅拌，加热至３７℃，加入体积为质量百分比含量为８％的双醛 化红细胞溶液１．２５倍的质量体积比为０．０１％的鞣酸溶液，全部加完后搅拌３０～６０分钟，离心，弃上清，红细胞泥用０．１５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ６．４的ＰＢＳ洗涤，离心后在沉淀物内加入体积为质量百分比含量为８％的双醛化红细胞溶液的３．９２５倍的０．１５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ６．４的ＰＢＳ即为２％的双醛化鞣酸化红细胞； （３）鸭肝炎Ｉ型病毒抗原致敏双醛化鞣酸化绵羊红细胞： 将鸭肝炎Ｉ型病毒抗原贮存液用０．１５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ为６．４的ＰＢＳ溶液稀释１０倍，将稀释后的鸭肝炎Ｉ型病毒 抗原溶液加入２倍体积的质量百分比浓度为８％双醛化鞣酸化红细胞悬液，充分混合，３７℃水浴致敏６０～９０分钟，１５００ｒ／ｍｉｎ离心１０～１５分钟，沉淀加３倍体积的质量百分比浓度为０．２５％的血清白蛋白悬浮，３７℃水浴３０～６０ｍｉｎ，１５００ｒ／ｍｉｎ离心１０～１５ｍｉｎ，沉淀用０．１５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ为６．４的ＰＢＳ溶液洗涤，加入体积为鸭肝炎Ｉ型病毒抗原储存液１６０倍的０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ为７．０的ＰＢＳ溶液，即成鸭肝炎Ｉ型病毒间接血凝诊断抗原。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陶海静，
申请(专利权)人：陶海静，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]
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