一种基于核酸适配体的四环素比色检测法制造技术

本发明专利技术公开了一种基于核酸适配体的四环素比色检测法。所述的比色检测法包括以下几个步骤：(1)制备胶体金溶液，加入四环素高亲和性核酸适配体和阳离子混合物，形成稳定的检测体系。(2)制备所述四环素标准溶液和对照溶液，加入步骤(1)所述的检测体系中，观察体系颜色的变化并记录其在650nm和520nm波长处的吸光度值，绘制标准曲线。(3)将待测样品加入检测体系，基于体系颜色的变化和对应标准曲线，即可求出样品中四环素的浓度。与现有技术相比，本发明专利技术能够实现对水体、牛奶等溶液中四环素的快速、简便、普适性检测。

A colorimetric assay for tetracycline based on nucleic acid aptamers

The invention discloses a tetracycline colorimetric detection method based on a nucleic acid aptamer. The colorimetric detection method comprises the following steps: (1) preparing colloidal gold solution, adding tetracycline, a high affinity nucleic acid aptamer and a cationic mixture to form a stable detection system. (2) prepare the tetracycline standard solution and the contrast solution, add step (1), observe the change of the system color and record the absorbance value of the 650nm and 520nm wave in the detection system, and draw the standard curve. (3) the concentration of tetracycline in the sample can be calculated based on the change of the system color and the corresponding standard curve. Compared with the prior art, the invention can realize rapid, simple and Pu Shi detection of tetracycline in water, milk and other solutions.

【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸适配体的四环素比色检测法
本专利技术属于食品安全技术和分析化学
涉及一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，特别涉及纳米金颗粒、阳离子混合物和非标记四环素适配体形成的稳定体系检测样品中四环素的方法。
技术介绍
四环素(tetracycline，TET)是一种重要的广谱抗菌药物，从放线菌金色链球菌的培养液分离而来，属于氢化并四苯环衍生物。四环素能阻碍氨酰tRNA与核糖体的结合而影响菌体蛋白的合成，具有稳定的药性，优良的抗菌性，因此被用来抑制革兰氏阴性菌、阳性菌、立克次体等生长。另外，由于价格低廉，能促进动物生长等作用，四环素也被用作饲料添加剂广泛应用于畜牧业及水产养殖业。我国每年约有上千万吨兽用抗生素用于畜禽饲料添加剂，占全球抗生素饲料添加剂使用量的一半，其中四环素类抗生素在我国及世界畜禽养殖业中的生产量与实际使用量均为最大。然而四环素在动物体内并不能被完全吸收代谢，大部分以原药或代谢物的形式随尿，粪便等排出，并进入土壤、地表水及地下水等环境中，不仅污染环境、破坏微生态系统平衡，而且会对人类健康带来直接或间接的危害。为了保障消费者的食品安全，我国农业部修订的235号公告《动物食品中兽药最高残留限量》中规定所有动物性食品中四环素类药物的最高残留量为100-600μg/kg，其中牛/羊奶中四环素残留量为100μg/kg。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，本专利技术提供了一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，主要用以快速、简便地检测水体、牛奶等样品中的四环素残留量。本专利技术方法结合了胶体金颗粒在一定阳离子浓度下会发生聚沉变色的现象和适配体保护胶体金免于发生聚沉的作用而检测四环素含量，检测体系颜色和吸光度的变化与四环素的含量具有一定的线性关系。相比于上述现有技术，本方法具有操作灵活简便，不依赖专业技术人员，普适性强等优势。本专利技术采用以下技术方案：一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，包括：(1)制备胶体金溶液，并加入四环素高亲和性核酸适配体和阳离子混合物形成稳定的检测体系；(2)制备四环素标准溶液和对照溶液，加入步骤(1)所述检测体系中，观察相应的颜色变化并记录其在650nm和520nm波长处的吸光度值，绘制标准曲线；(3)将待测样品加入检测体系，基于体系颜色的变化和对应标准曲线，求出待测样品中四环素的浓度。进一步的，步骤(1)中，对所述四环素高亲和性核酸适配体的DNA序列具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。进一步的，步骤(1)中，所述的胶体金溶液制备方法包括：将100ml，0.01％的氯金酸溶液煮沸后，加入2.2ml，1％柠檬酸三钠溶液，观察溶液颜色由灰色变为红色后在室温下冷却，得到的胶体金溶液分装于离心管中，在4℃～10℃保存待用。进一步的，步骤(1)中，所述四环素高亲和性核酸适配体浓度为10μM。进一步的，步骤(1)中，所述阳离子混合物为阳离子聚合物PDM和NaCl的混合物。进一步的，步骤(1)中，所述NaCl浓度为0.14M，孵育条件为25℃，10min。进一步的，步骤(2)中，所述的四环素标准液含一系列浓度梯度，所述的浓度梯度范围为：0～10,000nM。进一步的，步骤(2)中，所述标准曲线绘制步骤包括：记录不同浓度四环素标准溶液在650nm和520nm波长条件下的吸光度值，根据吸收光比率(y＝A650/A520)绘制四环素浓度的标准曲线。进一步的，所述标准曲线回归曲线方程为y＝0.1468x+0.282，相关系数R2为0.993，(y＝A650/A520)为不同四环素浓度下紫外吸收值比率，x为相应四环素的浓度。进一步的，步骤(3)中，所述待测样品中四环素浓度为：根据样品测得的吸收值比率(y＝A650/A520)，对应标准曲线，求出待测样品中四环素的浓度。与现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益效果：本专利技术方法由于利用胶体金颜色变化以达到检测四环素的目的，提供了一种简便、快速、灵敏、可肉眼观察的快速分析技术；进一步的，本专利技术方法的灵敏度高，选择了PDM和NaCl混合物作为阳离子溶液，具有增大检测灵敏度，降低检测限的优势；进一步的，本专利技术方法的特异性好，这是由选择的适配体高的亲和性和强的特异性决定的；进一步的，本专利技术方法中适配体无需标记，操作不依赖大型仪器和专业技术人员，检测成本低，普适性强。下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。【附图说明】图1为基于核酸适配体的四环素比色检测法的原理图；图2为不同阳离子混合物浓度下胶体金的吸收光谱图；图3为不同浓度四环素的吸光度；图4为四环素标准溶液紫外吸收值比率A650/A520与四环素浓度之间关系的线性拟合图；图5为不同物质加入检测体系中形成检测体系后的吸光度比值A650/A520。【具体实施方式】本专利技术检测方法的原理是(如图1所示)，纳米金强烈的粒子间距光学效应，其在分散状态下呈红色，而在高盐浓度下发生凝聚后变蓝。四环素适配体通过暴露带正电荷的碱基与胶体金表面的负电荷发生静电作用而直接吸附在胶体金表面，以此保护胶体金颗粒在高盐浓度下免于发生凝集变色。当向检测体系中加入含有四环素的样品时，适配体与四环素发生特异性结合，从纳米金表面解离，失去单链保护的纳米金在高盐浓度下发生凝集，体系颜色由酒红色变为紫色甚至是蓝色。体系的颜色变化和引起的吸光值比率的变化程度与四环素的含量成正比，基于此实现对水体、牛奶等样品中四环素的检测。本专利技术涉及一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，具体步骤如下：步骤一，制备胶体金溶液，并加入四环素高亲和性核酸适配体和阳离子混合物形成稳定的检测体系。步骤二，制备所述四环素标准溶液和对照溶液，加入步骤一所述的检测体系中，观察体系颜色的变化并记录其在650nm和520nm波长处的吸光度值，绘制标准曲线。步骤三，将待测样品加入检测体系，基于体系颜色的变化和对应标准曲线，即可求出样品中四环素的浓度。进一步的，步骤一中所述胶体金溶液是由柠檬酸钠和氯金酸摩尔比为3:1制备得到的。进一步的，步骤一中所述对四环素特异性识别且亲和力高的核酸适配体的DNA序列具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。基于此适配体，保证了本专利技术检测方法的特异性与灵敏性。进一步的，步骤一中所述的四环素适配体浓度为10μM。进一步的，步骤一中所述的阳离子混合物包括阳离子聚合物PDM和NaCl，孵育条件为25℃，10min。基于此，使胶体金充分聚沉变色，提高检测灵敏度。进一步的，步骤二中所述的四环素标准液具有一系列浓度梯度，所述的浓度梯度范围为：0～10000nM。基于此标准液浓度梯度，绘制四环素标准曲线；进一步的，步骤二中所述的标准曲线绘制步骤包括：记录四环素标准溶液在650nm和520nm波长条件下的吸光度值，根据吸收光比率A650/A520绘制四环素浓度的标准曲线；进一步的，步骤三中，所述的待测样品中四环素含量的计算是指：根据样品测得的吸收值比率A650/A520，对应标准曲线，即可求出待测样品中四环素的浓度。进一步的。步骤三中所述的标准曲线回归曲线方程为y＝0.1468x+0.282，相关系数R2为0.993。(y＝A650/A520)为不同四环素浓度下紫外吸收值比率，x为相应四环素的浓度。实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于，包括：(1)制备胶体金溶液，并加入四环素高亲和性核酸适配体和阳离子混合物形成稳定的检测体系；(2)制备四环素标准溶液和对照溶液，加入步骤(1)所述检测体系中，观察相应的颜色变化并记录其在650nm和520nm波长处的吸光度值，绘制标准曲线；(3)将待测样品加入检测体系，基于体系颜色的变化和对应标准曲线，求出待测样品中四环素的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于，包括：(1)制备胶体金溶液，并加入四环素高亲和性核酸适配体和阳离子混合物形成稳定的检测体系；(2)制备四环素标准溶液和对照溶液，加入步骤(1)所述检测体系中，观察相应的颜色变化并记录其在650nm和520nm波长处的吸光度值，绘制标准曲线；(3)将待测样品加入检测体系，基于体系颜色的变化和对应标准曲线，求出待测样品中四环素的浓度。2.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于：步骤(1)中，对所述四环素高亲和性核酸适配体的DNA序列具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于：步骤(1)中，所述的胶体金溶液制备方法包括：将100ml，0.01％的氯金酸溶液煮沸后，加入2.2ml，1％柠檬酸三钠溶液，观察溶液颜色由灰色变为红色后在室温下冷却，得到的胶体金溶液分装于离心管中，在4℃～10℃保存待用。4.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在于：步骤(1)中，所述四环素高亲和性核酸适配体浓度为10μM。5.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体的四环素比色检测法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔令洪，孔宇，杨贵芳，杨桂芳，陈述濛，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61