一种红曲色素的发酵制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高色价兼具高生物安全的红曲色素发酵制备方法，其以可溶性淀粉、硫酸盐等为原料制备液态发酵培养基，并在液态发酵的基础上结合硅胶柱层析法去除红曲色素发酵液中的桔霉素，可在提高红曲色素产量的同时有效去除桔霉素，为红曲色素在食品方面得到更广泛的应用打下了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物发酵制备领域，具体涉及一种高色价兼具高生物安全的红曲色素发酵制备方法。
技术介绍
红曲色素是由红曲霉属的丝状真菌经发酵产生的次级代谢产物，其因性质稳定、着色性好、无毒等优点常被选作高质的天然食用色素。但传统红曲色素的生产时间长，效率较低，且生产过程中常伴随着桔霉素的生成。而桔霉素具有强烈的肾毒性，国家标准（GB/T5009.222-2008）中对红曲液态、固态样品中桔霉素含量的限定分别为：液态＜50μg/L；固态＜1mg/kg。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对传统技术的不足，提供一种高色价兼具高生物安全的红曲色素发酵制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种红曲色素的发酵制备方法，包括以下步骤：1）红曲霉种子液的制备：将两块直径为6mm的红曲霉菌饼接种于50mLPD液体培养基中，于30-32℃、120-150r/min条件下恒温振荡培养2-3d，得红曲霉种子液；2）红曲色素的发酵：按液态发酵培养基体积的10%接入步骤1）所得红曲霉种子液，32℃、180r/min条件下培养12d；3）发酵液中桔霉素的去除：培养结束后，将所得发酵液与体积浓度为70-75%的乙醇溶液按体积比1:7-1:10混合摇匀，室温下避光静置20-40min，取出后4000r/min离心5-10min，所得上清液于旋转蒸发器中55℃-60℃条件下蒸干，再加入少量体积浓度为70-75%的乙醇溶液溶解，得浓缩液；取所得浓缩液采用硅胶柱层析进行分离，并根据硅胶柱上不同颜色的区间带分别进行收集，将红色区间带收集得到的洗脱液于旋转蒸发器中55℃-60℃蒸干，即得去除桔霉素的红曲色素。所用红曲霉菌为紫色红曲霉183-3。所述PD液体培养基的制备方法为：将200g马铃薯去皮、切块，于1000mL水中煮沸半小时，然后用纱布过滤，滤液中添加20g葡萄糖，待其充分溶解后加水补足至1000mL，再于121℃灭菌30min，即得。所述液态发酵培养基中含12wt%可溶性淀粉、1wt%蛋白胨、0.02wt%ZnSO4、0.02wt%MnSO4、0.005%FeSO4，其初始pH值为4.5-5.0。所述硅胶柱层析分离采用湿法上柱；所用柱子的径高比为1:10-1:15；所用硅胶为80-120目，其重量为上样浓缩液体积的20-25倍；所用洗脱剂为乙酸乙酯，其流速为1-2滴/s。本专利技术的显著优点在于：（1）本专利技术在液态发酵培养基中以可溶性淀粉作为碳源，并添加硫酸盐发酵红曲霉，可大大提高红曲色素的产量，其产量可达350.8U/mL，与现有发酵工艺相比（红色价为138.3U/mL）相比，红曲色素产量提高了1.54倍。（2）本专利技术在液态发酵的基础上结合硅胶柱层析法进行制备，可有效去除桔霉素，经HPLC检测，所得红曲色素中桔霉素含量为17.2μg/L，达国标要求。（3）本专利技术在大幅度提高红曲色素产量的同时可有效去除桔霉素，其方法操作简单，实用性强，为红曲色素在食品方面得到更广泛的应用打下了基础。附图说明图1为发酵后所得发酵液的高效液相色谱图。图2为柱层析分离后所得样品溶液的高效液相色谱图。具体实施方式为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。所用紫色红曲霉183-3为申请人自行选育获得，其选育方法参见“高产红色素及糖化酶红曲菌株的诱变选育”（徐美爱等，《中国食品学报》，2015，15(2)：74-82）。实施例1液态发酵（1）取紫色红曲霉183-3菌株斜面，用灼烧灭菌后的接种环挑取孢子于PDA平板上划线，30℃培养3-4d，挑取生长快、菌落大的进行传代培养，获得生长力旺盛的红曲霉菌株；（2）用打孔器在红曲霉平板上打出2个菌饼（6mm），接种到PD液体培养基中（培养基分装于250mL锥形瓶中，装液量为50mL/瓶），置于往复式摇床中，于32℃、120r/min条件下恒温振荡培养3d，得红曲霉种子液；（3）将液态发酵培养基分装于250mL锥形瓶中，装液量为50mL/瓶，然后接入5mL红曲霉种子液，于32℃、180r/min条件下培养12d，得发酵液。所用PD液体培养基的制备方法为：将200g马铃薯去皮、切块，于1000mL水中煮沸半小时，然后用纱布过滤，滤液中添加20g葡萄糖，待其充分溶解后加水补足至1000mL，再于121℃灭菌30min，即得。所用液态发酵培养基中含12wt%可溶性淀粉、1wt%蛋白胨、0.02wt%ZnSO4、0.02wt%MnSO4、0.005%FeSO4，其初始pH值为5.0。实施例2桔霉素的去除（1）取发酵液10mL，加入90mL体积浓度为75%的乙醇溶液，震荡混匀，室温下避光放置20min，取出后4000r/min离心8min，所得上清液于旋转蒸发器中55℃蒸干，再加入5mL体积浓度为75%乙醇溶液溶解，得浓缩液；（2）将10g、80-120目的柱层析用硅胶用乙酸乙酯浸泡后湿法装柱，柱子的直径为10mm，装柱高度为10cm；取0.5mL浓缩液上样，以乙酸乙酯为洗脱剂进行洗脱，洗脱剂流速控制在1-2滴/秒，根据硅胶柱上不同颜色的区间带分别进行收集；（3）将红色区间带收集得到的洗脱液于旋转蒸发器中55℃蒸干，加入3mL体积浓度为75%的乙醇溶液溶解，得样品溶液。实施例3HPLC检测方法采用配有荧光检测器的高效液相色谱系统色谱柱：HITACHILaChromUltraC18(150mm×4.6mm，粒度5µm)；流动相：乙腈：超纯水（用磷酸调pH至2.5）=35：65；检测器：荧光检测器，激发波长331nm，发射波长500nm；进样量：20µL；流速：1mL/min；柱温：28℃。实验结果：图1、2分别为所检测发酵液与样品溶液的高效液相色谱图。从图中可以看出，发酵液中桔霉素（t=12.989）含量较高，而经硅胶柱层析后的样品溶液中几乎不含有桔霉素。经计算，发酵液中桔霉素含量为39.09mg/L，而经硅胶柱层析分离后样品溶液中桔霉素含量为17.2μg/L，符合国家标准要求（液态＜50μg/L），且红曲色素收率为66.98%。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例，凡依本专利技术申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本专利技术的涵盖范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红曲色素的发酵制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）红曲霉种子液的制备：将两块直径为6 mm的红曲霉菌饼接种于50mL PD液体培养基中，于30‑32℃、120‑150r/min条件下恒温振荡培养2‑3d，得红曲霉种子液；2）红曲色素的发酵：按液态发酵培养基体积的10%接入步骤1）所得红曲霉种子液，32℃、180r/min条件下培养12d；3）发酵液中桔霉素的去除：培养结束后，将所得发酵液与乙醇溶液按体积比1:7‑1:10混合摇匀，室温下避光静置20‑40min，取出后4000 r/min离心5‑10 min，所得上清液于55℃‑60℃条件下蒸干，再加入乙醇溶液溶解，得浓缩液；取所得浓缩液采用硅胶柱层析进行分离，并根据硅胶柱上不同颜色的区间带分别进行收集，将红色区间带收集得到的洗脱液于55℃~60℃蒸干，即得去除桔霉素的红曲色素。

【技术特征摘要】
1.一种红曲色素的发酵制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）红曲霉种子液的制备：将两块直径为6mm的红曲霉菌饼接种于50mLPD液体培养基中，于30-32℃、120-150r/min条件下恒温振荡培养2-3d，得红曲霉种子液；2）红曲色素的发酵：按液态发酵培养基体积的10%接入步骤1）所得红曲霉种子液，32℃、180r/min条件下培养12d；3）发酵液中桔霉素的去除：培养结束后，将所得发酵液与乙醇溶液按体积比1:7-1:10混合摇匀，室温下避光静置20-40min，取出后4000r/min离心5-10min，所得上清液于55℃-60℃条件下蒸干，再加入乙醇溶液溶解，得浓缩液；取所得浓缩液采用硅胶柱层析进行分离，并根据硅胶柱上不同颜色的区间带分别进行收集，将红色区间带收集得到的洗脱液于55℃~60℃蒸干，即得去除桔霉素的红曲色素。2.根据权利要求1所述的红曲色素发酵制备方法，其特征在于：所用红曲霉为紫色红曲霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：林娟，陈景智，李亮，苏冰梅，叶秀云，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35