一种抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种抗体及其制备方法和应用，本发明专利技术所涉及的两种细胞分别为：亚克隆细胞A(名称：杂交瘤细胞1D7C11，2015年5月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏编号：CCTCC C201544)、亚克隆细胞B(名称：杂交瘤细胞11F11E4，2015年5月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏编号：CCTCC C201545)。所述抗体通过将阳性亚克隆细胞A或B分泌生产的；本发明专利技术所述抗体在检测蛋白药物时灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
在正常生理条件下，血管的生成是一个受多个环节严密调节的过程，对修复和维持机体的正常功能具有重要的作用。然而，如果肿瘤内部血管快速生长，则是临床常见的现象之一。大量的动物模型和人体临床试验表明，阻断肿瘤内新生血管的形成可以有效地阻止肿瘤的生长和引发肿瘤细胞的死亡，从而达到对肿瘤的治疗作用。因此，抑制血管新生是目前抗肿瘤新药研究的重要方向之一，另外，对于老年性视网膜血管病变(Age-related macular degeneration，简称为AMD)、糖尿病视网膜病变、关节炎等多种与血管新生相关的疾病，抑制血管新生的治疗新药也有广泛和重要的作用。血管新生是一个由多种活性生物因子进行调控的复杂过程，其中一个关键环节是内皮细胞表面受体与多种生长因子相结合从而被激活，然后经细胞内酪氨酸磷酸化的信号传递系统控制内皮细胞活动，从而促使血管新生。在多种生长因子中，血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor，简称为VEGF)是控制血管新生最重要的因子，是诱导和促进血管形成作用最强、最专一的血管生长因子，在几乎所有的人体肿瘤中都过量表达，是抗癌研究的一个重要分子靶标。VEGF在血管内皮细胞表面上有多种受体，其中包括VEGFR-1(又称为Flt-1)和VEGFR-2(又称为KDR或Flk-1)，它们的细胞外部分均由七个可与VEGF相结合的免疫球蛋白样区域(D1-D7)组成，细胞内部分均包括酪氨酸激酶基团。当受体被VEGF激活后，细胞内的酪氨酸激酶基团发生磷酸化，并导致一系列的信号传递，最终引发血管新生。由于VEGF信号传递对血管新生的重要性，阻断VEGF或VEGF受体从而达到抑制血管新生具有重要的抗癌作用，同时也对其他包括视网膜血管病变等与血管新生相关的疾病有着重要的治疗作用。在药物的研制过程以及后期临床应用过程中，药代动力学研究数据是必不可少的，因为它直接关系到药物的安全性和有效性。为了检测血清中抑制VEGF生长的药物的浓度变化，更好的分析抑制VEGF生长的药物的药代动力学特征，有效检测出血清中活性药物的含量变得越来越重要，尤其是检测下限越低，检测灵敏度越高，更能有效反映药物在血清中的药代动力学特征。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗体，该抗体可以用在利用ELISA检测血清中蛋白药物浓度等方面。本专利技术涉及两种细胞分别为亚克隆细胞A(名称：杂交瘤细胞1D7C11，2015年5月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏编号：CCTCC C201544)、亚克隆细胞B(名称：杂交瘤细胞11F11E4，2015年5月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏编号：CCTCC C201545)。为了达到上述目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术一方面提供了一种抗体，所述抗体通过亚克隆细胞A或B分泌生产。所述抗体优选由亚克隆细胞A或B分泌生产后使用亲和层析柱纯化获得。本专利技术还进一步提供了所述亚克隆细胞A或B的筛选方法，其具体如下：1)使用抗VEGF的重组蛋白作为免疫原免疫小鼠，收集免疫前血清和免疫后血清进行初步ELISA抗体筛选，免疫后6个月按时收集血清进行检测，同时保留所有血清样品供检测；2)获得阳性血清后，将选定的动物进行细胞融合；融合后的细胞放入96孔板进行培养，对培养细胞上清再进行一次正向筛选和反向筛选；将筛选到的阳性克隆放入24孔板进行扩增培养，对培养上清重新进行一次正向筛选和反向筛选，再对确定的阳性克隆进行一次亚克隆筛选，并对产生的抗体进行类型鉴别，挑选出IgG1或IgG2类型的阳性克隆；随后进行抗体表位分析并确定不同抗体间的配对情况，并评估所有阳性克隆与抗原间的相对亲和力，挑选亲和力及配对情况最好的一对抗体进行亚克隆；3)对挑选好的亚克隆母细胞进行进一步的不超过3代的亚克隆，并对每一个亚克隆培养细胞上清进行正向筛选和反向筛选；对于每个母细胞，培养出亚克隆细胞。上述抗VEGF的重组蛋白优选为康柏西普或阿柏西普本专利技术另一方面提供了上述抗体在利用ELISA法检测血清中蛋白药物浓度中的应用；其中所述蛋白药物为康柏西普或阿柏西普；所述ELISA法为夹心ELISA法。本专利技术更进一步提供了所述抗体在夹心ELISA法中检测血清中游离性康柏西普或游离性阿柏西普。本专利技术更进一步提供了所述抗体在夹心ELISA法中检测血清中结合型康柏西普或结合型阿柏西普。本专利技术所述抗体在检测蛋白药物时灵敏度高，且蛋白药物(如康柏西普或阿柏西普)最低线性浓度低，更适合用于检测血清中蛋白药物浓度，更适于用于评价药物的药代动力学特征。本专利技术中所述术语：游离型康柏西普(游离型阿柏西普)：是指未与靶蛋白(VEGF)结合的药物分子形式， 该形式的药物分子具有能结合靶蛋白(VEGF)的能力。结合型康柏西普(结合型阿柏西普)：是指与靶蛋白(VEGF)结合后的药物分子形式。阳性亚克隆细胞A对应抗体为抗体A阳性亚克隆细胞B对应抗体为抗体B附图说明图1为康柏西普(抗体A)线性范围筛选及结合比图2为康柏西普(抗体B)线性范围筛选及结合比图3为阿柏西普(抗体A)线性范围筛选及结合比图4为阿柏西普(抗体B)线性范围筛选及结合比图5为VEGF对康柏西普/阿柏西普信号抑制率(抗体A)图6为VEGF对康柏西普/阿柏西普信号抑制率(抗体B)具体实施方式现通过以下实施例对本专利技术作进一步阐释。应当理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而非对本专利技术有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本专利技术实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。实施例1：抗体的制备 1、动物免疫 使用抗VEGF的重组蛋白(如康柏西普或阿柏西普)作为免疫原免疫5只小鼠，收集免疫前血清和免疫后血清进行初步ELISA抗体筛选，免疫后6个月按时收集血清进行检测，同时保留所有血清样品供检测。其中，ELISA筛选采用正向筛选(使用免疫原)和反向筛选(使用人IgG-Fc)进行，以确保抗体为免疫原指定结构域抗体。2、细胞融合 获得阳性血清后，将选定的动物进行细胞融合。融合后的细胞放入96孔板进行培养，对培养细胞上清再进行一次正向筛选(使用免疫原)和反向筛选(使用人IgG-Fc)。将筛选到的阳性克隆放入24孔板进行扩增培养，对培养上清重新进行一次正向筛选(使用免疫原)和反向筛选(使用人IgG-Fc)，再对确定的阳性克隆进行一次亚克隆筛选，并对产生的抗体进行类型鉴别，挑选出IgG1或IgG2类型的阳性克隆。随后进行抗体表位分析并确定不同抗体间的配对情况，并评估所有阳性克隆与抗原间的相对亲和力，挑选亲和力及配对情况最好的一对抗体进行亚克隆。3、亚克隆、扩增以及保存对挑选好的亚克隆母细胞进行进一步的亚克隆(不超过3代)，并对每一个亚克隆培养细 胞上清进行正向筛选(使用免疫原)和反向筛选(使用人IgG-Fc)。对于每个母细胞，培养出阳性亚克隆细胞A或B进行保存。4、抗体生产、纯化及偶联使用摇瓶培养之前得到的亚克隆细胞，并通过亲和层析柱纯化出筛选的抗体，并对抗体进行纯度(SDS-PAGE)、浓度(UV-280nm)以及与抗原结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体，所述抗体通过将亚克隆细胞A(保藏编号：CCTCC C201544)或B(保藏编号：CCTCC C201545)分泌生产的。

【技术特征摘要】
2015.05.27 CN 20151027900041.一种抗体，所述抗体通过将亚克隆细胞A(保藏编号：CCTCC C201544)或B(保藏编号：CCTCC C201545)分泌生产的。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体由亚克隆细胞A(保藏编号：CCTCC C201544)或B(保藏编号：CCTCC C201545)分泌生产后使用亲和层析柱纯化出纯化获得。3.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述亚克隆细胞A或B的筛选方法如下：1)使用抗VEGF重组蛋白作为免疫原免疫小鼠，收集免疫前血清和免疫后血清进行初步ELISA抗体筛选，免疫后6个月按时收集血清进行检测，同时保留所有血清样品供检测；2)获得阳性血清后，将选定的动物进行细胞融合；融合后的细胞放入96孔板进行培养，对培养细胞上清再进行一次正向筛选和反向筛选；将筛选到的阳性克隆放入24孔板进行扩增培养，对培养上清重新进行一次正向筛选和反向筛选，再对确定的阳性克隆进行一次亚克隆筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯潇，朱文漓，
申请(专利权)人：成都康弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51