本发明专利技术一种Vsig4纳米抗体及其抗原表位鉴定方法和应用，属于生物制药技术领域。还公开了编码该纳米抗体的基因序列以及能够表达该纳米抗体的表达载体和宿主细胞，同时还公开了该纳米抗体和鼠源Vsig4和人源Vsig4结合的抗原表位。通过本发明专利技术所公开的纳米抗体基因序列表达载体和及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达并优化获得亲和力高且稳定均一的Vsig4纳米抗体蛋白，应用于Vsig4分子检测试剂的研发并作为阻断Vsig4蛋白分子和补体C3b结合的拮抗剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药
，涉及一种Vsig4纳米抗体，该抗体与Vsig4的氨基酸结合位点以及该抗体在制备抗癌症药物、靶向结合Vsig4阳性巨噬细胞和竞争抑制Vsig4和补体C3b分子结合中的用途。
技术介绍
Vsig4蛋白全称为V-set and immunoglobulin domain containing 4，是一种单次跨膜蛋白，人体中有两种存在形式，包括C2结构域和V结构域的长蛋白和只包括V结构域的短Vsig4蛋白，小鼠中只有一种含有V结构域的Vsig4蛋白。文献表明，虽然Vsig4的mRNA在不同的组织中如肝脏，肺，胎盘，滑膜和可能在中心神经系统组织等器官中表达，但其蛋白质在正常组织中，仅集中在肝脏巨噬细胞，滑膜等组织中有微量表达，在其他免疫器官几乎没有表达，因此，Vsig4具有高度巨噬细胞表达特异性。Vsig4蛋白促进巨噬细胞的吞噬微生物的作用。Vsig4与补体系统中的C3b或C3c结合，参与C3b介导的调理作用并抑制补体激活通路的活化，研究表明，在早期感染阶段可以清除体内的致病菌，表达Vsig4的柯弗氏细胞(Kupffer cell)是一种肝脏固有巨噬细胞，这种细胞可以通过Vsig4直接或间接的在肝脏的肝脏血窦部位捕捉通过的致病菌如李斯特菌(listeria monocytogens)和金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。因此，Vsig4在人体清除细菌的感染过程中发挥了重要作用。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是近年来肿瘤发生和免疫逃逸机制的热点关注的细胞，是指单核吞噬细胞浸润至肿瘤间质内且数量众多，在肿瘤微环境的“再教育”下，参与肿瘤的发生、生长、侵犯、转移、肿瘤新生血管和淋巴管生成，并能通过抑制特异性T细胞免疫、协助肿瘤逃逸的巨噬细胞。一方面，TAM的数量和密度与肿瘤预后结果成反比，如肿瘤过表达的巨噬细胞分化和趋化因子M-CSF及CCL-2，其治疗效果显著较差；与此同时，TAMs的数量与肿瘤的生长成正比，最高可以达到肿瘤总细胞数的60％，故而将TAMs表面分子作为靶标影像设计探针，为肿瘤的早期诊断提供了新的可行性。另一方面有研究表明，TAMs通过分泌免疫抑制细胞因子IL-10、TGF-β和高表达B7家族免疫调节分子，抑制T细胞活性，协助肿瘤的免疫逃逸，因此针对减弱TAMs免疫逃逸作用所设计的药物，将有良好的肿瘤治疗前景。最近研究者用免疫组织化学方法在非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中，检测到大量的Vsig4阳性TAMs细胞。并且在Vsig4基因敲除的小鼠中，肿瘤的成瘤率明显下降，肿瘤组织体积明显减小。此外一系列研究表明Vsig4在肿瘤组织中异常升高，在乳腺癌患者基因表达芯片研究中发现Vsig4的表达量高出对照组织的5倍。Vsig4在神经胶质瘤患者的基因表达也高于正常组。这些说明，Vsig4在肿瘤中的表达随着TAMs的逐渐增多而大量增加，因此Vsig4有作为肿瘤发展过程中TAMs标志性蛋白质的潜力。Vsig4是B7免疫调节受体家族的成员，B7家族蛋白在抑制T细胞增殖和免疫应答中起关键作用。B7家族受体在T细胞的增殖和活化过程中起到协同刺激分子的作用，如B7-CD28家族在调节T细胞的免疫应答中起到了关键作用，而近年来抗肿瘤免疫治疗的免疫检测点的程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)和细胞程式死亡-配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PD-L1)是目前B7家族蛋白的研究热点。据报道Vsig4具有免疫抑制的作用，在体外试验中，Vsig4的可溶性重组蛋白能直接抑制CD4+、CD8+T细胞和NKT细胞增殖和活性，并抑制IL-2细胞因子的表达。因此，Vsig4可能像其它B7家族的分子一样，在肿瘤的免疫逃逸过程中发挥至关重要的作用。研究表明，Vsig4分子作为一种负性调节分子可以显著抑制T细胞增殖和T细胞相关细胞因子的释放，Vsig4的可溶性重组蛋白能直接抑制CD4+、CD8+T细胞和自然杀伤T细胞(natural killer T，NKT)细胞增殖和活性，并抑制白介素-2(Interleukin-2，IL-2)的表达。因此，Vsig4分子本身也在肿瘤的生成和发展起着重要的调节作用通过靶标的天然识别分子(多肽、抗体、核酸适配体等)所介导的方法是实现主动靶向研究细胞表面受体的主要手段，特异性抗体不但可以用于基础实验研究和临床标本检测而且可作为在体示踪剂。比利时布鲁塞尔自由大学首次在世界上发现骆驼属动物体内存在天然的缺失轻链的重链抗体(HCAbs)，只包含一个重链可变区VHH和两个常规的CH2与CH3区。用单克隆表达获得VHH单域抗体，也称为纳米抗体(Camelid single-domain antibody-fragment,Nanobody)。纳米抗体是目前己知的可结合目标抗原的最小抗体单位，纳米抗体不但具有高稳定性和高亲和力，容易标记的特点，且仅是普通IgG抗体大小的十分之一。纳米抗体能够与多肽、蛋白质和膜受体结合，并可以大批量、自动化生产。纳米抗体具有良好的生物工程潜力，可以人工表达针对同一靶标或不同靶标的双分子或多分子纳米抗体，或者基于不用的用途，在纳米抗体上做不同的标记，如生物素、荧光集团和同位素等。通过二十几年的研究，纳米抗体已经应用于多个研究领域，作为检验，治疗手段等等，相关文献200多篇。而且具有可大规模发酵生产、价格低廉、免疫源性低、易于普及应用等优势，在生物医药领域有着广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种Vsig4纳米抗体及其抗原表位鉴定方法和应用。本专利技术是通过以下技术方案来实现：本专利技术公开了一种抗Vsig4鼠源和人源纳米抗体，该纳米抗体能够同时抗鼠源Vsig4和人源Vsig4，包括框架区和互补决定区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示。该Vsig4纳米抗体的VHH链，包括四个框架区域(framework region，FR)和三个抗原互补决定区域(complementarity-determining region，CDR)。该Vsig4纳米抗体的VHH链，具有SEQ ID NO.：1所示的氨基酸序列。其中，所述框架区FR1-FR4的氨基酸序列分别选自下组的SEQ ID NO.：2，SEQ ID NO.：4，SEQ ID NO.：6和SEQ ID NO.：8。三个抗原互补决定区域(CDR1-CDR3)的氨基酸序列分别选自下组的SEQ ID NO.：3，SEQ ID NO.：5和SEQ ID NO.：7。本专利技术公开了编码Vsig4纳米抗体的核苷酸序列，如SEQ ID NO.:9所示。本专利技术提供一种原核表达载体，它含有所示Vsig4纳米抗体VHH。本专利技术提供一种原核宿主细胞，它含有所述Vsig4纳米抗体VHH的表达载体。本专利技术公开的一种Vsig4纳米抗体与鼠源Vsig4结合的抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:10所示。本专利技术公开的一种Vsig4纳米抗体与人源Vsig4结合的抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:11所示。本专利技术还公开了一种鉴定抗Vsig4纳米抗体抗原表位的方法，包本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Vsig4纳米抗体，其特征在于，该纳米抗体能够同时抗鼠源Vsig4和人源Vsig4，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种Vsig4纳米抗体，其特征在于，该纳米抗体能够同时抗鼠源Vsig4和人源Vsig4，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的Vsig4纳米抗体，其特征在于，该Vsig4纳米抗体的重链包括4个框架区FR1～FR4，以及3个抗原互补决定区CDR1～CDR3；其中：4个框架区FR1～FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.：2、SEQ ID NO.：4、SEQ ID NO.：6和SEQ ID NO.：8所示；3个抗原互补决定区CDR1～CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.：3，SEQ ID NO.：5和SEQ ID NO.：7所示。3.根据权利要求1所述的Vsig4纳米抗体，其特征在于，编码所述Vsig4纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.:9所示。4.一种Vsig4纳米抗体与鼠源Vsig4结合的抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:10所示。5.一种Vsig4纳米抗体与人源Vsig4结合的抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:11所示。6.一种鉴定Vsig4纳米抗体抗原表位的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑芳，温玉荣，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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