本发明专利技术属于分析领域，涉及乳腺癌细胞内源性生物大分子乙酰化p53蛋白同位素定量分析，利用免疫共沉淀，凝胶电泳等技术手段对细胞复杂基质样品中乙酰化p53蛋白进行提取分离纯化。步骤如下：利用重组人p53蛋白、乳腺癌细胞内p53蛋白经胰蛋白酶水解产生的特异性肽段进行定性定量的策略，以特异性肽段序列内氨基酸进行稳定碳13、氮15同位素标记的合成肽段为内标，实现了对乳腺癌细胞样品中DNA结合区特异性位点乙酰化p53蛋白的定量。本发明专利技术主要包括样品提取及凝胶电泳方法、Obitrap测定方法、标准曲线的制备和精密度测定。本发明专利技术方法线性关系良好、准确度高、重现性好，可用于乙酰化p53蛋白在细胞内的定量。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于分析领域，涉及乳腺癌细胞内源性生物大分子乙酰化p53蛋白同位素定量分析，利用免疫共沉淀，凝胶电泳等技术手段对细胞复杂基质样品中乙酰化p53蛋白进行提取分离纯化。步骤如下：利用重组人p53蛋白、乳腺癌细胞内p53蛋白经胰蛋白酶水解产生的特异性肽段进行定性定量的策略，以特异性肽段序列内氨基酸进行稳定碳13、氮15同位素标记的合成肽段为内标，实现了对乳腺癌细胞样品中DNA结合区特异性位点乙酰化p53蛋白的定量。本专利技术主要包括样品提取及凝胶电泳方法、Obitrap测定方法、标准曲线的制备和精密度测定。本专利技术方法线性关系良好、准确度高、重现性好，可用于乙酰化p53蛋白在细胞内的定量。【专利说明】人乳腺癌细胞乙酰化P53蛋白同位素标记定量方法
本专利技术涉及一种利用同位素标记结合轨道阱(obitrap)质谱技术对人乳腺癌细胞内DNA结合区的功能性位点乙酰化p53蛋白的定量方法。
技术介绍
乳腺癌已经成为全球范围女性最常见的癌症，p53基因是迄今为止已发现的与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，与乳腺癌肿瘤生长、调亡及耐药关系密切。乳腺癌细胞受到化疗药物刺激之后，P53蛋白表达上调，启动下游一系列细胞凋亡程序，从而杀死肿瘤细胞，P53蛋白表达量增加，可明显抑制肿瘤血管生成，抑制肿瘤转移。DNA损伤过程中p53经历复杂的翻译后修饰作用，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等，其中乙酰化是P53蛋白活化并产生功能的必要条件，DNA结合区位点的乙酰化与肿瘤细胞凋亡密切相关。现有的P53蛋白定量方法主要是Western Blot方法，这种方法只能达到相对定量的目的，并且无法对一些特定乙酰化位点进行定量。相对于Western Blot方法，同位素质谱定量技术具有更好的选择性和精密度。建立人乳腺癌细胞内DNA结合区位点乙酰化p53的细胞样品同位素定量方法对于观察肿瘤细胞状态，研究化疗药物药效具有重要的意义，对改善临床给药方案，减低抗肿瘤药物毒性反应和肿瘤复发是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，建立人乳腺癌细胞DNA结合区的功能性位点乙酰化P53蛋白的提取方法并建立其质谱定性定量方法。本专利技术采取的技术方案是，首先利用免疫共沉淀技术，经抗体吸附纯化后用SDS-PAGE分离，硝酸银染色。经胰蛋白酶胶内消化后轨道离子阱质谱(Orbitrap)检测内源性P53蛋白的特异性乙酰化肽段，选择的乙酰化特异性肽段是该的蛋白胰酶水解后独有的。基于轨道离子阱质谱(Orbitrap)，利用多种模式对特异性肽段进行分析，建立可靠，稳定质谱定量方法。合成与特异性乙酰化肽段序列相同并用稳定同位素C13、N15标记该肽段的氨基酸作为内标，进行定量分析建立标准曲线，从而实现特异性肽段的定量，进而对蛋白的表达量进行分析。本专利技术的具体技术方案如下所述。人乳腺癌细胞内源性乙酰化p53蛋白同位素标记定量方法，包括细胞样品的提取方法和质谱定量方法，具体步骤如下:A、细胞样品提取方法:(I)样品总蛋白的制备:收集细胞蛋白，加入NP40温和裂解液100 μ L(已加蛋白酶抑制剂)，冰上超声破碎，16000g4度离心30分钟，取上清，并测定蛋白浓度。(2)免疫共沉淀提取过程:洗磁珠:将50 μ L磁珠加入到Iml的PBS中，14000g，4°C离心lmin，重复2次，弃上清。磁珠加入到蛋白质中，4°C摇床lh。14000g，4°C离心lmin，弃底，移上清至新的EP管中，加抗体(Hyg/^OOyg细胞总蛋白)及IgG，4°C摇床过夜。次日，洗磁珠2次。14000g，4°C离心lmin。向磁珠中加入抗体蛋白混合液，4°C摇床3h。14000g，4°C离心lmin。弃上清，留底(磁珠)。洗磁珠3次(第一，第二次用PBS，第三次用lysis)，瞬时离心。向磁珠中加入2X b μ ffer (25~30 μ L),沸水煮5min, 12000rpm,离心5min,电泳。银染过程:固定:配制固定液，固定I~3h,摇床,室温。敏化:固定结束后换用敏化液，敏化30min。水洗:倒出敏化液，以ddH20洗5minX3次。染色:银染20min。水洗:倒出银染液后，以ddH20洗1.5minX I次。显色:加入显色液后仔细观察凝胶显色情况，直至蛋白质点完全显现为止，一般约需要5~IOmin左右。终止:倒出显色液后，立即加入终止液，终止显色lOmin。保存:终止后以ddH20洗10minX2次，换成10%乙醇溶液保存使用。 打开通风橱，用水和酒精小心仔细擦拭超净台；用ddH20洗胶3次，每次超声5min(胶污染较多时，可用10%乙醇代替ddH20) ;3000rpm，lmin离心，弃液，用ACN脱色5min，银染胶为灰白色有弹性为止；3000rpm，lmin离心，弃液，加入IOmM DTT50 μ L，56°C水浴 Ih ；3000rpm, lmin 离心，弃液，加入 55mM IAA50 μ L,暗处避光，45min ；3000rpm, lmin 离心，弃液，依次加入25mM NH4HC03,50% ACN, 100% ACN，逐级脱水；(3)蛋白样品的胰蛋白酶消化:加酶(10叩/1^)，一个胶粒对应2~31^，每多一个胶粒，多加I μ L的酶，4°C或冰上静止30min，小心吸出多余酶液。加入8.5 μ LNH4HC03作为覆盖液，放入37°C水浴，过夜。加入2% TFA终止反应，至终浓度为0.1%。(4)低温冻干，复溶，样品肽段除盐后进样。B、LTQ Orbitrap Velos 质谱仪条件为:反相分离肽段所用的A相跟B相体系是:A相(含0.1%的甲酸的乙腈)，B相(含0.1%的甲酸的水)。肽段分析:运用LTQ Orbitrap Velos质谱仪与纳升液相色谱柱串联来完成的。质谱扫描后获得分析谱图的质核比范围是350-1800，从一级扫描图谱中选取20个强度最高的离子进行HCD模式碎裂获得二级谱图(用Xcalibur质谱软件进行实时监测)，动态质谱窗口间隔是60秒。Orbitrap Velos检测得到的RAW文件用MaxQuant (vl.2.2.5)检索，根据标准工作流程检索鉴定到的谱图，峰值列表检索对照UniPiOtKB人类蛋白质组序列数据库，接着计算乙酰化P53蛋白量。表1肽段监测值【权利要求】1. 人乳腺癌细胞内源性乙酰化P53蛋白同位素标记定量方法，包括样品的提取方法和质谱定量方法，具体步骤如下:生物样品提取方法: 提取制备样品总蛋白；利用免疫共沉淀进行提取，其中抗体浓度为l_2yg / 200yg细胞总蛋白；蛋白样品的胰蛋白酶消化；加酶(IOng / uL),—个胶粒对应2到3uL,每多出一个胶粒，多加至少IuL的酶，4°C或冰上静止放置30min，小心地吸出多余酶液。并加入8.5uLNH4HC03作为覆盖液，再放入37°C水浴，保持温度过夜；次日再加入2% TFA终止反应，至终浓度达到0.1%。低温冻干，0.1%甲酸复溶样品，肽段经过除盐后进样。2.LTQ Orbitrap Velos 质谱仪条件为: 反相分离肽段所用的A相跟B相体系是:A相(含0.1%的甲酸的乙腈)，B相(含0.1%的甲酸的水)。肽段分析:运用LT本文档来自技高网...
【技术保护点】
生物样品提取方法：提取制备样品总蛋白；利用免疫共沉淀进行提取，其中抗体浓度为1?2μg／200μg细胞总蛋白；蛋白样品的胰蛋白酶消化；加酶(10ng／uL)，一个胶粒对应2到3uL，每多出一个胶粒，多加至少1uL的酶，4℃或冰上静止放置30min，小心地吸出多余酶液。并加入8.5uL?NH4HCO3作为覆盖液，再放入37℃水浴，保持温度过夜；次日再加入2％TFA终止反应，至终浓度达到0.1％。低温冻干，0.1％甲酸复溶样品，肽段经过除盐后进样。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王广基，汤志远，郝海平，吴梦秋，李盈淳，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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