利用微生物生产甜菊糖苷类化合物的方法技术

本发明专利技术涉及利用微生物生产甜菊糖苷类化合物的方法。本发明专利技术首次揭示了甜菊糖苷类化合物异源生物合成的关键酶，应用牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)，古巴焦磷酸合成酶(CDPS)和贝壳烯合成酶(KS)或双功能贝壳烯合酶(CPS/KS)，贝壳烯氧化酶(KO)，细胞色素P450氧化还原蛋白(CPR)，贝壳烯酸-13α-羟化酶，UGT85C2糖基转移酶，和UGTB1/IBGT糖基转移酶；以及可选地还应用UGT74G1糖基转移酶，和/或UGT76G1糖基转移酶，进行甜菊糖苷类化合物的异源生物合成。

【技术实现步骤摘要】
利用微生物生产甜菊糖苷类化合物的方法
本专利技术属于合成生物学领域；更具体地，本专利技术涉及利用微生物生产甜菊糖苷类化合物的方法。
技术介绍
莱鲍迪苷A(RebA)是从甜叶菊(Steviarebaudiana)中提取的新型天然甜味剂，它具有甜度高，热值含量低，稳定性好等特点。莱鲍迪苷A与其它甜菊糖苷相比，它的甜度最高，约为蔗糖的450倍以上，热值仅为蔗糖的1/300。莱鲍迪苷A甜度高、色泽洁白、甜味纯正、无异味，因此它是一种蔗糖以及化学合成甜味剂的天然最佳替代品，被国际上誉为“世界第三糖源”。目前从甜叶菊中分离得到的甜菊糖苷类化合物的结构式如图1所示，随着R1、R2为不同，产生不同侧链修饰的的甜菊糖苷类化合物，具体见表1。甜菊糖中莱鲍迪苷A含量越高，甜味就越纯正，也就受越多的消费者青睐，因此在甜菊糖生产过程中必须提高产品中莱鲍迪苷A的含量。表1、从甜叶菊分离的甜菊糖苷类化合物目前，甜菊糖苷类化合物已被广泛的用于食品、饮料、医药、化妆品等行业。最新研究表明，甜菊糖苷类化合物还具有预防高血压，糖尿病，心脏病等保健作用。因此，甜菊糖苷类化合物的需求在近年来快速增长。目前市场上的莱鲍迪苷A主要是从甜菊叶中提取，制备流程主要为：干燥粉碎甜菊叶、液相浸提、除杂、树脂处理、喷雾干燥和精制等步骤。通常情况下，甜叶菊叶片可以积累多达占干重4%-20%的甜菊糖。但是甜菊的种植需要占用大量的土地，而且甜菊糖生产存在甜菊品质参差不齐、原料转化效率不高和提取产品的纯度低等诸多问题。因此研究一种原料易得、生产安全和提取方法简单的新型的莱鲍迪苷A大规模生产方法显得非常必要。随着近十年合成生物学技术的进步，利用微生物异源合成的方法生产某些化合物成为可能。它将具有成本低，占地面积少，产品质量易控等优，但目前还未见有异源生物合成莱鲍迪苷A的报道，其关键的技术难题是，在莱鲍迪苷A生物合成途径中，从甜菊醇单糖苷经一步糖基化反应得到甜菊醇双糖苷的转移酶是未知的。因此，本领域迫切需要克服现有技术难题，实现莱鲍迪苷A的微生物合成。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用微生物生产甜菊糖苷类化合物的方法。本专利技术在第一方面，提供了一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽是非甜叶菊来源的糖基转移酶，用于催化在甜菊糖苷类化合物的O-葡萄糖残基的C-2’再转移上一个糖。优选地，其氨基酸序列与甜叶菊来源的具有同一功能的酶的氨基酸序列一致性不大于95%，较佳的，不大于80%；较佳的，不大于70%；较佳的，不大于60%；较佳的，不大于50%；更佳的，不大于40%；更佳的，不大于30%。在一个优选例中，所述的非甜叶菊来源糖基转移酶来源于斯塔摩酵母(Starmerellabombicola)或甘薯(Ipomoeabatatas)。在另一优选例中，所述的来源于斯塔摩酵母的糖基转移酶，其特征在于，具有如SEQIDNO:41的氨基酸序列(称为UGTB1)或在SEQIDNO:41基础上经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白。在另一优选例中，所述的来源于甘薯的糖基转移酶，其特征在于，具有如SEQIDNO:51所示的氨基酸序列(称为IBGT)，或在SEQIDNO:51基础上经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白。本专利技术在另一方面，提供了一种分离的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码非甜叶菊来源的糖基转移酶，用于催化在甜菊糖苷类化合物的O-葡萄糖残基的C-2’再转移上一个糖。在一个优选例中，所述的核苷酸序列具有：(1)如SEQIDNO:42所示的序列，或与SEQIDNO:42同源度在70%及以上的序列(较佳的，在80%以上；更佳的在90%以上，更佳的在95%以上)(2)如SEQIDNO:52所示的序列，或与SEQIDNO:52同源度在在70%及以上的序列(较佳的，在80%以上；更佳的在90%以上，更佳的在95%以上)。在另一优选例中，所述的核苷酸序列是(1)如SEQIDNO:42所示的序列或(2)如SEQIDNO:52所示的序列。本专利技术在另一方面，提供了一种非甜叶菊来源的糖基转移酶的用途，用于在宿主细胞中重组表达以制备甜菊糖苷类化合物，其特征在于，催化在甜菊糖苷类化合物的O-葡萄糖残基的C-2’再转移上一个糖。在一个优选例中，所述的糖基转移酶的催化底物包括但不限于甜菊醇-13-O-葡萄糖苷(又称甜菊醇单糖苷)、甜茶素(又称甜叶悬钩子苷)、甜菊糖苷、莱鲍迪苷A；优选的，催化甜菊醇单糖苷生成甜菊醇双糖苷。本专利技术在另一方面，提供了一种合成甜菊糖苷类化合物的方法，其特征在于，在宿主细胞中重组表达能催化在甜菊糖苷类化合物的O-葡萄糖残基的C-2’再转移上一个糖的非甜叶菊来源的糖基转移酶。。在一个优选例中，所述的宿主细胞还含有下述中的一个或多个：(a)牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶，(b)选自以下(I)或(II)的酶：(I)古巴焦磷酸合成酶和贝壳烯合成酶，(II)双功能贝壳烯合酶，(c)贝壳烯氧化酶，(d)细胞色素P450氧化还原蛋白，(e)贝壳烯酸-13α-羟化酶，(f)UGT85C2糖基转移酶，(h)UGT74G1糖基转移酶，(i)UGT76G1糖基转移酶。在另一优选例中，所述的的宿主细胞还含有包括以下酶的基因表达盒：1-脱氧木糖-5-磷酸合成酶，2-甲基赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶，2-甲基赤藓糖-2,4-环二磷酸合成酶和异戊烯焦磷酸异构酶。在另一优选例中，所述的宿主细胞选自：原核微生物细胞或真核微生物细胞。在另一优选例中，所述的原核微生物是：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌；更佳地，所述大肠杆菌选自：BL21、BLR、DH10B、HMS、CD43、JM109、DH5α或Noveblue；或所述的真核微生物细胞是：酵母菌、霉菌、担子菌；所述的酵母菌是：毕赤酵母，酿酒酵母，乳酸克鲁维酵母。较佳地，所述的毕赤酵母选自GS115、MC100-3、SMD1163、SMD1165、SMD1168或KM71；较佳地，所述的酿酒酵母选自W303、CEN.PK2、S288c、FY834或S1949；较佳地，所述的乳酸克鲁维酵母选自GG799。在本专利技术的另一方面，提供一种合成甜菊糖苷类化合物的方法，包括：在细胞中重组表达(较佳地，为异源表达)：(a)牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)，(b)选自以下(I)或(II)的酶：(I)古巴焦磷酸合成酶(CDPS)和贝壳烯合成酶(KS)，(II)双功能贝壳烯合酶(CPS/KS)，(c)贝壳烯氧化酶(KO)，(d)细胞色素P450氧化还原蛋白(CPR)，(e)贝壳烯酸-13α-羟化酶，(f)UGT85C2糖基转移酶，和(g)UGTB1/IBGT糖基转移酶；培养所述的细胞，从而生成甜菊糖苷类化合物。在一个优选例中，还包括重组表达：(h)UGT74G1糖基转移酶，和/或(i)UGT76G1糖基转移酶。在另一优选例中，重组表达所述的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、古巴焦磷酸合成酶、贝壳烯合成酶、贝壳烯氧化酶、贝壳烯酸-13α-羟化酶、UGT85C2糖基转移酶和UGTB1/IBGT糖基转移酶，从而合成甜菊醇双糖苷。在另一优选例中，重组表达所述的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、古巴焦磷酸合成酶、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽是非甜叶菊来源的糖基转移酶，用于催化在甜菊糖苷类化合物的O‑葡萄糖残基的C‑2’再转移上一个糖。

【技术特征摘要】
2012.09.29 CN 201210378341.31.一种合成甜菊糖苷类化合物的方法，其特征在于，在宿主细胞中重组表达非甜叶菊来源的糖基转移酶；所述的非甜叶菊来源糖基转移酶是来源于斯塔摩酵母(Starmerellabombicola)的UGTB1或来源于甘薯(Ipomoeabatatas)的IBGT；所述的来源于斯塔摩酵母的UGTB1的氨基酸序列如SEQIDNO:41；所述的来源于甘薯的IBGT的氨基酸序列如SEQIDNO:51所示；所述的宿主细胞选自：大肠杆菌，毕赤酵母，酿酒酵母；所述的宿主细胞还含有：(a)牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶，(b)选自以下(I)或(II)的酶：(I)古巴焦磷酸合成酶和贝壳烯合成酶，(II)双功能贝壳烯合酶，(c)贝壳烯氧化酶，(d)细胞色素P450氧化还...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，熊智强，李诗渊，汪建峰，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31