本发明专利技术公开了一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应用，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala和/或第20位由Arg突变为Lys，将突变后的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶与大肠杆菌原有的MEP途径结合，构建了高效合成异戊二烯的工程菌株，利用该菌株进行发酵生产异戊二烯。重组菌异戊二烯合成能力较原始菌株提高1.5倍以上。
【技术实现步骤摘要】
一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应 用
本专利技术涉及一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，以及利用该突变体构建重组菌发酵生产异戊二烯的方法。
技术介绍
异戊二烯又名2-甲基-1,3-丁二烯，是一种共轭二烯烃，易自身聚合，也易与其它不饱和化合物共聚合，因此，异戊二烯是一种重要的合成橡胶单体。在工业上，可被齐格勒-纳塔催化剂催化聚合合成聚异戊橡胶，即天然橡胶；异戊二烯还可以用作合成丁基橡胶的一种共聚单体，以改进丁基橡胶的硫化性能。此外，异戊二烯在农药、医药、香料及粘结剂等领域也有广泛的应用。目前，异戊二烯的主要来源是石油裂解精馏，是碳五馏分的重要组分。碳五馏分组成复杂，直接精馏难以得到纯度较高的异戊二烯产品，通常采取萃取精馏及共沸精馏法由裂解碳五馏分中分离高纯度异戊二烯，增加了异戊二烯的生产成本。除碳五馏分分离得到异戊二烯外，工业上还采用合成法生产；例如采用碳五以下的有机原料，如丙烯、异丁烯、甲醛、丙酮和乙炔来合成。随着石化资源的枯竭，研究者们开始寻找新的异戊二烯生产方法，利用微生物转化可再生的生物质资源生成异戊二烯，因其可再生型和对环境友好型，是一条具有潜在应用前景的途径。生物体内有两条途径合成异戊二烯，MVA途径和MEP途径。MVA途径存在于真核生物及古细菌中，而MEP途径主要存在于植物质体、真菌和各种细菌中。到目前为止，采用生物法合成异戊二烯的最有产量是通过MVA途径实现的，美国的Genercor公司在工程大肠杆菌中利用MVA途径进行异戊二烯合成，最高产量可以达到60g/L以上(美国专利技术专利:2009/0203102);通过MEP途径合成异戊二烯的报道产量目前都还比较低(Zhao etal.，Applied Microbiology and Biotechnology, 2011，90 (6): 1915-22)。然而，与 MVA 途径相比，MEP途径具有更高的理论产量，其产量较低推测是由于该途径中的关键酶活性不高的原因造成的。2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶催化MEP生成2_甲基_4_ 二磷酸胞苷赤藓糖醇(CDP-ME)(图1 )，是MEP途径中的关键反应。在大肠杆菌中，该酶是一个同源二聚体，由ispD 基因编码,其结构已经得到了解析(Kemp et al., Acta Crystallographica SectionD, 2003, 59:607)。本专利技术通过采用易错PCR技术对该酶进行定点突变，获得了改性的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶，并整合到完整的MEP途径中，在发酵水平提高了异戊二烯的产量。
技术实现思路
本专利技术提供了一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala。本专利技术提供了一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第20位由Arg突变为Lys。本专利技术提供了一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Ρι.ο突变为Ala，第20位由Arg突变为Lys0本专利技术采用易错PCR的手段对大肠杆菌的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶进行突变，并结合下游合成β_胡萝卜素的途径进行筛选，获取了较之大肠杆菌(Escherichia coli K_12 MG1655)原始2_甲基赤藓糖醇4_磷酸胞苷酰转移酶催化活性明显提闻的酶。所述2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。本专利技术专利还提供了采用2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体增强大肠杆菌合成异戊二烯能力的方法。利用突变后的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶提高异戊二烯合成能力的方法还包括:(a)将突变后的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体连接原核表达载体；(b)将该表达载体导入大肠杆菌感受态细胞与大肠杆菌已有的MEP途径相整合；(c)利用导入该2-甲基赤藓糖醇4 -磷酸胞苷酰转移酶的重组大肠杆菌发酵合成异戊二烯。本专利技术所提供的利用突变后的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶提高异戊二烯合成能力的宿主细胞，优选大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3))。有益效果:I)本专利技术所制备的提供的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，导入大肠杆菌中后，所获得的工程菌株其异戊二烯合成能力较原始菌株提高1.5倍以上，该结果有望推动生物法制备异戊二烯工业化的进程。2)本专利技术是针对异戊二烯合成途径单一关键酶进行的改造，可以与合成途径中其它酶进行整合，并对其它酶的改造提供指导作用，从而有望进一步提高异戊二烯的合成能力。3)本专利技术所提供的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，其作用不仅仅限于提高异戊二烯的合成能力。该突变体对于异戊二烯合成途径下游的各种萜类化合物的合成理论上同样具有促进作用，有可能应用于其它高附加值产品的合成。【附图说明】图12-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶催化的反应图2pEASY_ispD 载体图谱图3ispD基因突变子与原始基因序列的比对[0021 ] 图4异戊二烯气相色谱检测【具体实施方式】实施例1:大肠杆菌2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因(ispD)的克隆，具体过程如下:以寡核苷酸5’- CAT GCC ATG GCA ACC ACT CAT TTG GAT G -‘3 和 5’- CCG GAATTCTTA TGT ATT CTC CTG ATG GAT GG -‘3为引物，以大肠杆菌的总DNA为模版，采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因，PCR体系和条件如下所示:本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种2?甲基赤藓糖醇4?磷酸胞苷酰转移酶突变体，是2?甲基赤藓糖醇4?磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala和/或第20位由Arg突变为Lys。
【技术特征摘要】
1.一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala和/或第20位由Arg突变为Lys。2.如权利要求1所述突变体，其特征在于，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala。3.如权利要求2述突变体，其特征在于，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala和第20位由Arg突变为Lys。4.如权利要求1所述突变体，其特征在于，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第20位由Arg突变为Lys。5.权利要求1-4所述任一2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示。6.一种发酵生产异戊二烯的方法，其特征在于，步骤如下: 1)将权利要求1-4所述任一2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体连接原核表达载体； 2)将步骤1)得到的表达载体导入大肠杆菌感受态细胞与大肠杆菌已有的MEP途径相整合； 3)利用导入该2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体的重组大肠杆菌发酵合成异戊二烯。7.如权利要求6所述方法，其特征在于，大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。8.如权利要求6所述方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，曹玉锦，刘炜，王纪明，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。