本发明专利技术属于生物工程下游蛋白质纯化技术领域，具体涉及重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法，具体的通过包涵体裂解、rTPA38DEAE柱纯化、rTPA38蛋白稀释复性、rTPA3830Q柱纯化等步骤最终获得了精纯的rTPA38蛋白。本方法适合工业化大生产，纯化复性一体化，批量可一次性纯化50g至200g包涵体。rTPA38目的蛋白纯度高，可达95%以上，再经过转盐后，完全符合使用要求。
【技术实现步骤摘要】
—种适用于工业化生产的重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法
本专利技术属于生物工程下游蛋白质纯化
，具体涉及重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌复合群感染引起的多器官感染性疾病，主要为肺结核。其中我国每年新发患者高达150万。结核杆菌流行病学的一个重要特征是结核分枝杆菌的潜伏感染。结核分枝杆菌潜伏性感染是一种亚临床状态，无放射检查征象，细菌呈休眠状态，约有10%的结核分枝杆菌潜伏性感染人群一生中会发展成为结核病患者。目前结核杆菌潜伏感染人群尚无诊断金标准，PPD皮试试验是诊断结核杆菌潜伏感染人群的常用方法，但这一方法有一定的缺陷性，因为试验所用pro抗原为结核分枝杆菌、非致病性分枝杆菌和卡介苗(即BCG)所共有，具有交叉反应，诊断特异性差。我国是普遍接种卡介苗的国家，而由于卡介苗接种者和结核杆菌自然感染者对pro试验的反应在表现上很难区分，即使采用上述的pro皮试试验强阳性作为判断标准，仍然会有一部分卡介苗接种者以及非致病性分枝杆菌的感染者被纳入结核杆菌潜伏感染人群中，因此导致ppd试验在结核杆菌潜伏感染人群诊断中的实际作用十分有限。需寻找一种新的特异性高、副作用小的制剂代替。重组结核分支杆菌蛋白38K D a(r Τ P A38)是结核分支杆菌的一种脂蛋白和主要抗原，其诱 发豚鼠迟发型超敏反应D Τ Η的效果优于其它单一抗原。用于结核病血清学检测的敏感性和特异性较高。因此，r Τ P A38蛋白是目前具有较好应用前景的蛋白。大肠杆菌表达系统因遗传背景清楚、基因操作简单、表达水平高、发酵成本低和易于工业规模放大等优点而成为药用重组TPA38KDa (recombinant TPA38KD, rTPA38KDa)的理想宿主系统。因MTB与大肠杆菌在进化上近源，所以MTB来源的天然或经简单改造的TPA38KDa编码序列在强启动子(如T7启动子)的控制下很容易获得高效表达，表达水平一般能达到30%以上。与其它在大肠杆菌系统高效表达的目的蛋白一样，TPA38KDa的高效表达产物也是一种无活性的、水不溶的包涵体蛋白，必须采取适当的复性和纯化方法才能获得药用级的产品。但是现有技术中包涵体的初步纯化中得率低，成本高，难以应用于大规模生产。但是现有技术中，包涵体复性的回收率大约是15-25%，其占有大肠杆菌生产重组蛋白的绝大部分费用。因此，生物工程的一个很大挑战就是将这种没有活性和不可溶的蛋白更有效的转化为可溶和正确折叠的蛋白，因此，如果能够找到一种溶解的方法使包涵体溶解但又不使其二级结构丧失。这不仅可以使蛋白质复性成功率高，而且可以大大减少其生产活性蛋白的费用。因此，针对现有技术中的不足，亟需提供一种可工业化放大、便于质控、效率高、节约生产成本的药用级的重组包涵体蛋白的精纯方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供:一种重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法，收集扩增得到的大量包涵体，裂解、过柱纯化、复性、过柱纯化的步骤，最终得到精纯后的具有生物活性的r Τ P A38 蛋白。本专利技术的技术方案:一种重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法，包括如下步骤:一、包涵体裂解:取重组表达的rTPA38包涵体，按裂解缓冲液体积(mL):包涵体重量(g)约100:1的比例确定rTPA38包涵体裂解缓冲液的用量，室温搅拌溶解，至溶液基本澄清，无明显大颗粒沉淀存在，将裂解液置于4°C冰箱过夜。过滤:上柱纯化前用0.45μπι的过滤器过滤至20L ΡΡ桶中。 二、rTPA38DEAE柱纯化:层析柱:为硼硅玻璃材质，规格为GAG200/550 (内径200mm,柱高550mm),柱头筛网孔径标准10 μ m,填料为DEAESepharose,柱床高度约16-17cm,柱床体积约5-6L。( 1)层析柱平衡:用约4个柱床体积的rTPA38DEAE柱层析缓冲液(8M尿素，pH8.020mM Tris-HCl)平衡层析柱，平衡流速约500mL/min。(2)上样:将过滤后的rTPA38裂解液泵入层析柱，流速约500mL/min。(3)洗平:上样结束后，用rTPA38DEAE柱层析缓冲液(8M尿素，pH8.020mM Tris-HCl)洗平层析柱，平衡3_5个柱体积。(4)洗脱1:用 rTPA38DEAE柱层析缓冲液(8M尿素，pH8.020mM Tris-HCl, 20mM NaCl)第一次洗脱，洗脱流速约500mL/min，约冲洗12-15L，洗脱出的蛋白峰不收集。(5)洗脱2:用rTPA38DEAE柱层析缓冲液(8M尿素，pH8.020mM Tris-HCl, 60mM NaCl)第二次洗脱，洗脱流速约500mL/min。(6)收集:收集洗脱2出现的主峰(含目的蛋白的rTPA38的DEAE柱层析液)于10L PP桶中，层析柱在线处理，第一步洗脱完成。三、rTPA38蛋白稀释复性:(1)加入rTPA38DEAE柱层析液:在150L稀释复性罐内按稀释复性缓冲液(1.8M 尿素，0.5mM GSS, 5mM GSH，，10% 甘油，pH8.020mM Tris-HCl)与含目的蛋白的rTPA38的DEAE柱层析液的体积比例49:1，先加入含目的蛋白的rTPA38的DEAE柱层析液，并打开150L稀释复性罐夹套内的冷冻水进行冷却至保持12°C以下。(2)滴加稀释复性缓冲液(1.8M 尿素，0.5mM GSS, 5mM GSH, 10% 甘油，pH8.020mM Tris-HCl):将用硅胶管把150L缓冲液储罐出液口与150L稀释复性罐的进液口连接起来，中间用蠕动泵把硅胶管夹紧，为稀释复性缓冲液滴加提供动力。先把150L缓冲液储罐内的稀释复性缓冲液冷却至15°C以下，开始滴加，稀释复性缓冲液(1.8M尿素，0.5mM GSS, 5mM GSH，，10%甘油，pH8.020mM Tris-HCl)以300ml/min的流速滴加入150L稀释复性罐内，并同时开启150L稀释复性罐的搅拌，以25HZ进行搅拌，从稀释复性缓冲液滴加开始计算，稀释复性约16小时，稀释复性完成。四、rTPA3830Q柱纯化:层析柱:硼硅玻璃材质，规格为GAG200/550 (内径200mm，柱高550mm),柱头筛网孔径标准10 μ m,填料为Source30Q,柱床高度约160-200mm,柱床体积约5-6L。( 1) 30Q柱平衡:用约2-3个柱床体积的rTPA3830Q柱层析缓冲液(10%甘油，2M尿素，pH8.020mM Tris-HCl)平衡层析柱，平衡流速约500mL/min。(2)上样:将过滤后的rTPA38稀释复性液泵入层析柱，流速约600mL/min。(3)洗平:上样结束后，用约3_5个柱床体积的rTPA3830Q柱层析缓冲液(10%甘油，2M尿素，pH8.020mM Tris-HCl)洗平层析柱。(4)线性梯度洗脱:将rTPA3830Q柱层析缓冲液(10%甘油，2M尿素，pH8.020mM Tris-HCl)接入层析系统的A泵，rTPA3830Q柱层析缓冲液(200mM NaCl，10%甘油，2M尿素，pH8.020mMTris-HCl)接入层析系统的B泵，设定洗脱方式为从100%的A泵洗到100本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用于工业化生产的重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法，其包括以下步骤：包涵体裂解：取重组表达的rTPA38包涵体，按裂解缓冲液体积（mL）：包涵体重量（g）100：1的比例确定rTPA38包涵体裂解缓冲液的用量，室温搅拌溶解，至溶液基本澄清，无明显大颗粒沉淀存在，用0.45μm的过滤器过滤至20L?PP桶中；rTPA38DEAE柱纯化：（1）层析柱平衡：用约4个柱床体积的rTPA38DEAE柱层析缓冲液：8M尿素，pH8.020mM?Tris?HCl，平衡层析柱，平衡流速约500mL/min；（2）上样：将过滤后的rTPA38裂解液泵入层析柱，流速约500mL/min；（3）洗平：上样结束后，用rTPA38DEAE柱层析缓冲液：8M尿素，pH8.020mM?Tris?HCl，洗平层析柱，平衡3?5个柱体积；（4）洗脱1：用rTPA38DEAE柱层析缓冲液：8M尿素，pH8.020mM?Tris?HCl，20mM?NaCl，第一次洗脱，洗脱流速约500mL/min，约冲洗12?15L，洗脱出的蛋白峰不收集；（5）洗脱2：用rTPA38DEAE柱层析缓冲液：8M尿素，pH8.020mM?Tris?HCl，60mM?NaCl，第二次洗脱，洗脱流速约500mL/min；（6）收集：收集洗脱2出现的主峰，含目的蛋白的rTPA38的DEAE柱层析液于10L?PP桶中，层析柱在线处理，第一步洗脱完成；rTPA38蛋白稀释复性：（1）加入rTPA38DEAE柱层析液：在150L稀释复性罐内按稀释复性缓冲液与含目的蛋白的rTPA38的DEAE柱层析液的体积比例49:1，先加入含目的蛋白的rTPA38的DEAE柱层析液，并打开150L稀释复性罐夹套内的冷冻水进行冷却至保持12℃以下；（2）滴加稀释复性缓冲液，将用硅胶管把150L缓冲液储罐出液口与150L稀释复性罐的进液口连接起来，中间用蠕动泵把硅胶管夹紧，为稀释复性缓冲液滴加提供动力。先把150L缓冲液储罐内的稀释复性缓冲液冷却至15℃以下，开始滴加，稀释复性缓冲液以300ml/min的流速滴加入150L稀释复性罐内，并同时开启150L稀释复性罐的搅拌，以25HZ进行搅拌，从稀释复性缓冲液滴加开始计算，稀释复性约16小时，稀释复性完成。rTPA3830Q柱纯化：（1）30Q柱平衡：用约2?3个柱床体积的rTPA3830Q柱层析缓冲液：10%甘油、2M尿素、pH8.020mM?Tris?HCl，平衡层析柱，平衡流速约500mL/min；（2）上样：将过滤后的rTPA38稀释复性液泵入层析柱，流速600mL/min；（3）洗平：上样结束后，用约3?5个柱床体积的rTPA3830Q柱层析缓冲液洗平层析柱；（4）线性梯度洗脱：将rTPA3830Q柱层析缓冲液：10%甘油，2M尿素、pH8.020mM?Tris?HCl，接入层析系统的A泵，rTPA3830Q柱层析缓冲液：200mM?NaCl、10%甘油、2M尿素、pH8.020mM?Tris?HCl，接入层析系统的B泵，设定洗脱方式为从100%的A泵洗到100%的B泵，洗脱流速约500mL/min，洗脱时间为120min，总洗脱体积约为10个柱体积；（5）收集：洗脱时，当出现第二个主峰为目的峰，当其280吸光值大于254吸光值时开始收集于10L?PP桶中，层析柱在线处理，30Q柱纯化完成。...
【技术特征摘要】
1.一种适用于工业化生产的重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法，其包括以下步骤:包涵体裂解:取重组表达的rTPA38包涵体，按裂解缓冲液体积(mL):包涵体重量(g)100: 1的比例确定rTPA38包涵体裂解缓冲液的用量，室温搅拌溶解，至溶液基本澄清，无明显大颗粒沉淀存在，用0.45 μ m的过滤器过滤至20L PP桶中；rTPA38DEAE柱纯化:(1)层析柱平衡:用约4个柱床体积的rTPA38DEAE柱层析缓冲液:8M尿素，pH8.020mM Tris_HCl，平衡层析柱，平衡流速约500mL/min ；(2)上样:将过滤后的rTPA38裂解液泵入层析柱，流速约500mL/min ；(3)洗平:上样结束后，用rTPA38DEAE柱层析缓冲液:8M尿素，pH8.020mM Tris_HCl，洗平层析柱，平衡3_5个柱体积；(4)洗脱1:用rTPA38DEAE柱层析缓冲液:8M尿素，pH8.020mM Tris-HCl, 20mM NaCl，第一次洗脱，洗脱流速约500mL/min，约冲洗12-15L，洗脱出的蛋白峰不收集；(5)洗脱2:用rTPA38DEAE柱层析缓冲液:8M尿素，pH8.020mM Tris-HCl, 60mM NaCl，第二次洗脱，洗脱流速约500mL/min ；(6)收集:收集洗脱2出现的主峰，含目的蛋白的rTPA38的DEAE柱层析液于10L PP桶中，层析柱在线处理，第一步洗脱完成；rTPA38蛋白稀释复性:(1)加入rTPA38DEAE柱层析液:在150L稀释复性罐内按稀释复性缓冲液与含目的蛋白的rTPA38的DEAE柱层析液的体积比例49:1，先加入含目的蛋白的rTPA38的DEAE柱层析液，并打开150L稀释复性罐夹套内的冷冻水进行冷却至保持12°C以下；(2)滴加稀释复性缓冲液，将用硅胶管把150L缓冲液储罐出液口与150L稀释复性罐的进液口连接起来，中间用蠕动泵把硅胶管夹紧，为稀释复性缓冲液滴加提供动力。先把150L缓冲液储罐内的稀释复性缓冲液冷却至15°C以下，...
【专利技术属性】
技术研发人员：何秀云，崔玉华，李申建，贺运泉，
申请(专利权)人：广东瀚森生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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