本发明专利技术公开了检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物，其特征在于，所述引物包括特异性扩增引物SEQNO.1、SEQNO.2，其序列为：SEQNO.1：ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC，SEQNO.2：Biotin-AATGTCAAGGACTGGCAAGAG。所述引物进一步还包括特异性测序引物SEQNO.3，其序列为：SEQNO.3：AGTCCCCAGCACCTG。本发明专利技术通过特异性引物扩增目的区域，并利用焦磷酸测序分析鉴定多态性，不但保证了一定的准确性及灵敏度，同时相对Sanger测序法具备了较短的检测周期，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物，其特征在于，所述引物包括特异性扩增引物SEQNO.1、SEQNO.2，其序列为：SEQNO.1：ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC，SEQNO.2：Biotin-AATGTCAAGGACTGGCAAGAG。所述引物进一步还包括特异性测序引物SEQNO.3，其序列为：SEQNO.3：AGTCCCCAGCACCTG。本专利技术通过特异性引物扩增目的区域，并利用焦磷酸测序分析鉴定多态性，不但保证了一定的准确性及灵敏度，同时相对Sanger测序法具备了较短的检测周期，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。【专利说明】检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物和方法本申请是申请号为201210331289.6、申请日2012年9月10日的中国专利申请的分案申请。
本专利技术属生命科学和生物
，特别是一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，采用基因测序技术，可以对DHFR (C829T)多态性位点进行检测。
技术介绍
骨髓抑制限制了多种化疗药物的应用，使之难以达到治愈或抑制肿瘤生长的效果，而一些耐药基因是产生骨髓抑制的分子基础，如二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolate reductase, DHFR)。DHFR是细胞内叶酸代谢的关键酶，分子量为22KD。在还原型辅酶II (NADPH)的参与下，DHFR能催化叶酸变成二氢叶酸，而后者为合成胸嘧啶核苷及嘌呤核苷输送了碳元素，因此DHFR是DNA、RNA及蛋白质等物质合成的其中一种关键酶。此外，DHFR也是抗代谢类抗肿瘤药物氨甲嘌呤(MTX)的靶酶。MTX是一种叶酸类似物，在临床上常用来治疗乳腺癌、急性白血病、淋巴瘤等多种肿瘤。其作用原理是通过竞争性与DHFR的活性位点紧密结合而使其失活，从而导致细胞中四氢叶酸含量下降，细胞DNA合成异常，造成细胞死亡。但是在治疗过程中一些肿瘤细胞很快对其产生耐药性，骨髓抑制的毒副作用也较严重、限制了其疗效。DHFR基因的SNP是导致肿瘤细胞对MTX产生耐药的一种因素。虽然MTX可以竞争性地抑制DHFR，但是当MTX和DHFR亲和力下降时，MTX抑制该酶的作用就会明显下降。诸多研究表明在一些耐药细胞中，由于DHFR基因中第829号核苷酸会发生T代替C的突变，即产生CC型(野生纯合型)、CT型(杂合型)、TT型(突变纯合型)三种基因型，而后两者导致了 DHFR蛋白质结构的改变，进而影响DHFR与MTX结合的空间结构，最终引起DHFR和MTX亲和力的下降，提高了细胞的抗药性。吴瑞琼等将含突变mDHFR的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞之 后进行细胞抗MTX分析，结果发现转导mDHFR耐药基因的脐血干细胞集落形成数明显高于对照组，同时对MTX的抗性提高了约2倍。另有资料显示将转导有人的突变mDHFR基因的小鼠骨髓移植到荷瘤小鼠后，再使用大剂量MTX治疗，结果表明转导有突变mDHFR基因的小鼠骨髓能耐受大剂量化疗的冲击治疗，并使44%的小鼠肿瘤完全消退，而对照组小鼠全部死亡。终上所述，正是由于DHFR中一个氨基酸的改变从而使细胞具有对MTX的耐受性。因此，检测肿瘤患者中DHFR (C829T)的基因型，有助于临床医生制定更具针对性的个体治疗方案，获得较佳效果的同时也减轻患者的经济与身体负担。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，可用于检测DHFR(C829T)位点是否发生突变。一种DHFR的C829T单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂，其特征在于: PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ N0.1、SEQ N0.2，其序列为:SEQ N0.1:ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC,SEQ N0.2 =Biotin- AATGTCAAGGACTGGCAAGAG ； 测序试剂包括特异性测序引物SEQ N0.3，其序列为:SEQ N0.3:AGTCCCCAGCACCTG。进一步地，所述PCR 试剂包括 2*PCR BufferUOmM dNTP、5U/yl Taq 酶、特异性扩增引物SEQ N0.1和SEQ N0.2、灭菌水；所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70%(V/V)乙醇、变性液、I XWash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。所述试剂盒的使用方法包括如下步骤: (1)提取样本中的DNA(2)以DNA为模板， 依据所述的特异性扩增引物(SEQN0.1、SEQ N0.2)进行PCR扩增； (3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化； (4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序； (5)结果分析。进一步地，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增:94°C 2min预变性；98°C10s、58°C 30s,68°C 30s，40 个循环；68°C 5min。步骤(3)单链纯化的具体步骤为:将得到的50 μ I PCR产物与3μ I 链亲和素包被的磁珠及47 μ I结合缓冲液混合,室温孵育l(Tl5min，期间震荡2~3次，然后使用Vaccuum prep tool吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuum prep tool先后放进70% (V/V)乙醇、变性液、IXWash Buffer中清洗IOs左右，再将Vaccuum prep tool放入含有49μ I 退火缓冲液及I μ I测序引物(SEQ Ν03)的96孔板中，释放磁珠，将该96孔板放置于80°C2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。步骤(5)结果分析的具体方法是将测序结果与标准序列对比，得到DHFR (C829T)位点的碱基类型。DHFR 部分标准序列为:ACTCTTGTCTCTATCAGATA CCATTTATGAGACATTCTTGCTATAACTAAGTGCTTCTCCAAGACCCCAACTGAGTCCCCAGCACCTGCTACAGTGAGCTGCCATTCCACACCCATCACATGTGGCACTCTTGCCAGTCCTTGACATTGTCGGGCTTTTCACATGTTGGTAATATTTAT。其中下划线部分为829位点。本专利技术的有益效果:目前，对于检测DHFR (C829T)多态性的最可靠的方法就是进行测序，而本专利技术通过特异性引物扩增目的区域，并利用焦磷酸测序分析鉴定多态性。该方法不但保证了一定的准确性及灵敏度，同时相对Sanger测序法具备了较短的检测周期，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。【专利附图】【附图说明】图1是样本A测序图。测序结果为:CTA￡AGTGAG，该样本是CC型(野生型)，图中红框部分是样本A基因型的判断区。图2是样本B测序图。测序结果为:CTAC (T)AGTGAG,该样本是CT型(杂合型)，图中红框部分是样本B基因型的判断区。图3是样本C测序图。测序结果为:CTAIAGTGAG，该样本是TT型(突变纯合型)，图中红框部分是样本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测DHFR的C829T单核苷酸多态性的引物，其特征在于，所述引物包括特异性扩增引物SEQ NO.1、SEQ NO .2，其序列为：SEQ NO.1：ACTAAGTGCTTCTCCAAGACC，SEQ NO.2：Biotin‑ AATGTCAAGGACTGGCAAGAG。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈奕磊，徐建成，王淑一，孙翠莲，
申请(专利权)人：济南艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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