本发明专利技术公开了口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒及药物。口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒，至少包括一对特异性扩增甲基化ZIC1基因的引物，所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物（ZIC1MSP-F）具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；下游引物（ZIC1MSP-R）具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。所述的试剂盒包括RT-PCR、实时定量PCR、MSP法试剂盒。治疗口腔癌的药物，以ZIC1基因为靶点。所述的药物，为药剂学上可接受的任何一种剂型，包括粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。本发明专利技术为口腔癌的诊断、预防或治疗提供了新的路径。
【技术实现步骤摘要】
口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒及药物
本专利技术涉及医药生物
，具体是口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒及药物。
技术介绍
肿瘤的发生发展是个多步骤过程，涉及到癌基因的活化和抑癌基因的失活。通过检测这些发生改变的癌基因和抑癌基因，可以在分子水平上早期检测到肿瘤的发生，从而为及时的干预阻挡创造机会。随着对肿瘤研究的深入，目前肿瘤的诊断和临床治疗都已经开始在分子水平展开。通过PCR和蛋白组学等技术，开发新的肿瘤相关标记物，正在日益提高肿瘤的早期诊断水平。而早期诊断和早期治疗是提高肿瘤治愈率的关键。同时，由于抑癌基因一般在肿瘤细胞中异常失活，因此恢复抑癌基因的功能一直以来被认为是抑制肿瘤进展的有效方法。而且，抑癌基因本身在正常组织细胞中表达并发挥防治肿瘤发生的重要作用，因此，增加抑癌基因的功能对正常细胞没有明显毒副作用，是一种相对安全的肿瘤特异性治疗方法。目前，已经有以恢复抑癌基因为目的的肿瘤治疗手段应用于肿瘤的临床防治，例如P53腺病毒等。随着分子生物学的进展，越来越多的抑癌基因被发现和鉴定，不仅拓展了我们对肿瘤发生的认识，也为肿瘤诊治手段的开发提供了更多的机会。人ZICl基因(Zinc fingerof the cerebeIlum)(Genbank N0.ΝΜ_001168378.I),其最终表达产生一种跨膜转运蛋白，可能是一个新的抑癌基因。 口腔癌是发生于口腔的常见恶性肿瘤，绝大多数为鳞状细胞癌，在临床中包括发生于舌、颊、口底、唇、牙龈等黏膜的癌瘤，浸润和转移出现较早，以淋巴道转移为主，一旦发生转移，生存率明显降低。口腔癌发生初期不易引起患者重视，最好的治疗方法是手术切除，但一般被确诊时往往已错过最佳手术期，即使此时可以手术，也会因为手术面积大而对口腔造成损害，不能回复正常形态与功能。因此，寻找有效的早期诊断及无创治疗方法是应对口腔癌的重要方向。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒及药物。口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒，至少包括一对特异性扩增甲基化ZICl基因的引物，所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物(ZIC1 MSP-F)具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；下游引物(ZIC1 MSP-R)具有如SEQ ID Ν0:2所示的核苷酸序列。所述的试剂盒，包括RT-PCR、实时定量PCR、MSP法试剂盒。治疗口腔癌的药物，以ZICl基因为靶点。所述的药物，为药剂学上可接受的任何一种剂型，包括粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。本专利技术的有益效果:为口腔的有效早期诊断及无创治疗方法提供了新的路径，使以甲基化ZICl基因为基础的诊断试剂及药物可方便快捷的在分子水平上实现口腔肿瘤的检测及治疗，同时，以ZICl基因为靶点和核心的试剂盒及药物可望成为口腔癌肿瘤检测及靶向治疗的一种新手段。【附图说明】图1是ZICl基因在口腔癌细胞中的表达(RT-PCI^i)结果琼脂糖凝胶电泳图； 图2是ZICl在去甲基化药物处理后口腔癌肿瘤细中的表达(RT-PCIUi)结果琼脂糖凝胶电泳图； 图3是MSP法(甲基化特异PCR)检测口腔癌肿瘤细胞中ZICl基因启动子DNA的甲基化情况(M表示甲基化，U表示非甲基化)结果琼脂糖凝胶电泳图； 图4是MSP法(甲基化特异PCR)检测口腔癌肿瘤组织中ZICl基因启动子DNA的甲基化情况(M表示甲基化；U表示非甲基化)结果琼脂糖凝胶电泳图； 图5是细胞克隆形成实验检测ZICl基因表达对Kb细胞克隆能力的影响图。【具体实施方式】下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本专利技术的内容。应当理解，本专利技术的实施并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本专利技术保护范围。在本专利技术中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。本专利技术所述的新抑癌基因ZICl基因在开发口腔癌肿瘤诊断、预防和治疗手段中的应用，可参考常规的药物配置方法和试剂开发。药物剂型和生物制剂为医学上认可的任何一种剂型，例如为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如Sambrook等作者的分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。试验试剂:Highfidelity PFU DNA聚合酶，Trizol试剂，小牛血清(FBS),磷酸盐缓冲液(PBS)，RPM1-1640培养基，青霉素-链霉素(P/S)和0.25%(ff/V)胰蛋白酶/ImM EDTA (Trypsin-EDTA)购于 Invitrogen (USA)。GoTaq 聚合酶从 Promega (USA)购得。肿瘤细胞系(SACC83, Kb, CAL27, TCA8113, A3A6, hn30 和 A2D3)分别从日本的 RikenBioResource Center细胞库和美国的ATCC购买。逆转录反应(RT)使用High CapacitycDNA Reverse Transcription试剂盒(美国Applied Biosystem公司)。亚硫酸氰盐修饰试剂盒以及MSP所用DNA聚合酶购自美国Zymo公司。实施例1 RT- PCR实验检测ZICl基因在口腔癌肿瘤细胞中的表达 1.细胞培养 所有细胞均采用RPM1-1640培养基，其中含100 U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素和10%FBS，于37°C 5% C02培养箱中进行培养。2.总RNA抽提试剂盒 细胞的总RNA是用Invitrogen公司的Trizol试剂按照生产厂商提供的方法分离提取。该试剂是基于酸性酚一步抽提法生产的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要进行无RNA酶处理，以保证实验中无RNA酶的环境。3.总RNA的抽提 培养细胞至对数生长期，吸干培养液后，直接加入Iml Trizol，室温下静置5分钟，收集细胞到1.5ml离心管中。加入氯仿后，4°C离心分层；将上层水相转入新鲜1.5ml离心管，加入Iml异丙醇，4°C离心沉淀RNA ;用1.5ml75%乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA质量鉴定:紫外分光光度计测定260/280比值(确认比值均在1.7-2.0)。并在MOPS甲醛变性胶中观察有无降解。4.cDNA 的合成 逆转录反应(RT)使用美国 Applied Biosystem 公司的 High Capacity cDNA ReverseTranscription试剂盒，每个反应使用2微克总RNA。加入2 X RT bufferlO微升和总RNAlO微升，反应总体积为20微升。使用ABI PCR仪进行逆转录反应，具体运行参数如下:25°C10分钟；37°C 120分钟；85°C 5分钟；冷却至4° C。-20° C保存备用。5.PCR 细胞ZICl的表达水平通过常规PCR法来检测，使用美国Promega公司的GoTaq聚合酶。反应总体积为20微升:采用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒，其特征在于，至少包括一对特异性扩增甲基化ZIC1基因的引物，所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物（ZIC1 MSP‑F）具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；下游引物（ZIC1 MSP‑R）具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种口腔癌诊断、预防或治疗中应用的试剂盒，其特征在于，至少包括一对特异性扩增甲基化ZICl基因的引物，所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物(ZIC1MSP-F)具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；下游引物(ZIC1 MSP-R)具有如SEQ ID NO: 2...
【专利技术属性】
技术研发人员：金洪传，王娴，许首芳，
申请(专利权)人：杭州博谱医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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