一种脂联素抗原、抗体及其胶乳试剂的制备方法以及脂联素检测试剂盒技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种脂联素抗原的制备方法，其通过表达阳性肿瘤细胞或者化学合成方法制备得到脂联素DNA序列，再通过原核表达、真核细胞表达得到脂联素抗原。将其作为免疫原通过动物免疫，制备得到脂联素单克隆抗体，其可用于制备脂联素检测胶乳试剂，制备得到的脂联素检测胶乳试剂能够应用于脂联素检测试剂盒。本发明专利技术克服了现有技术中的有关于脂联素抗原以及脂联素抗体的制备方法不明确，同时在脂联素检测试剂盒中的脂联素多抗会与Ⅷ型胶原、补体C1q和Ⅷ因子有交叉反应，导致最终测试结果的准确性较差的缺陷，本发明专利技术将脂联素重组蛋白单克隆IgG型抗体引入到脂联素检测试剂盒中能够有效提升试剂盒的测试精确度。

A method for the preparation of adiponectin antigen, antibody and latex reagent and a kit for the detection of adiponectin

【技术实现步骤摘要】
一种脂联素抗原、抗体及其胶乳试剂的制备方法以及脂联素检测试剂盒
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种脂联素抗原、脂联素抗体及其脂联素检测胶乳试剂的制备方法，同时还涉及一种脂联素检测试剂盒。
技术介绍
糖尿病已成为全球威胁人类健康的三大慢性非传染性疾病之一。虽然占总发病率95％以上的II型糖尿病在世界范围内广泛分布，但其患病率在不同国家、地区和种族中也存在区别。目前中国糖尿病患者总数高居世界第一的事实已经不容争辩，并且世界卫生组织预测至2025年全球糖尿病患者更是将突破3亿大军，这将为整个社会带来非常沉重的负担。糖尿病还是很多疾病的元凶。随着糖尿病的发展，患者往往会出现一系列并发症，包括心血管疾病、神经病变、视网膜病变及肾病，严重时可出现心肌梗塞、中风、足坏疽及肾衰竭。糖尿病一经确诊则无法逆转，目前还没有治愈糖尿病及其并发症的药物，现有药物只能控制血糖、延缓并发症的发生及减轻症状，患者需终生服药。而处在糖尿病前期的患者，大约有30％在十年左右会进展成为糖尿病(FerranniniE.etal.LancetDiabetesEndocrinol2:667-675(2014))。糖尿病防治的关键在于早期发现及预测糖尿病及糖尿病前期人群。脂联素(Adiponectin/ADPN)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，糖尿病人的血液中脂联素含量往往会有所升高。然而，脂联素检测的临床推广还面临一系列困难或障碍。首先其临床推广受限于目前脂联素的检测方法。脂联素的检测方法主要包括：酶联免疫分析法、放射免疫分析法、化学发光法等，酶联免疫分析法灵敏度高，但操作繁琐，难于实现全自动化检测；放射免疫分析法会对对操作人员产生危害，对环境造成污染，而化学发光法也存在操作繁琐成本高、仪器普及率低等缺点。这些缺点限制了现有脂联素检测方法的推广及应用，使其难于广泛的应用于科研及临床。胶乳免疫增强比浊法是近年来出现的一种较为快速、准确、稳定的液相免疫比浊检测方法。其基本原理是利用抗原抗体特异性结合，产生免疫沉淀反应引起液相浊度变化，来检测抗原的浓度。在一定范围内，抗原的浓度越高，免疫沉淀反应就越快，液相吸光度变化也越大。该技术通过采用纳米乳胶微球偶联特异性抗体，使抗原抗体形成的免疫沉淀物体积增大，从而放大检测信号，显著提高了检测的灵敏度。常规的胶乳免疫比浊法(例如授权公告号为CN103777023B的纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒、授权公告号为CN104237522B的脂联素含量检测试剂盒及其制备方法)的R1是透明澄清的缓冲液，R2是交联着抗体的胶乳颗粒，此方法的R2中交联的抗体一般是多抗，然而血液中Ⅷ型胶原、补体C1q和Ⅷ因子有交叉反应，最终导致测试结果准确性较差。
技术实现思路
本专利技术是为了克服现有技术中的有关于脂联素抗原以及脂联素抗体的制备方法资料较少，同时在脂联素检测试剂盒中的脂联素多抗会与Ⅷ型胶原、补体C1q和Ⅷ因子有交叉反应，导致最终测试结果的准确性较差的缺陷，提供了一种有效制备脂联素抗原以及脂联素抗体的制备方法，同时通过该脂联素抗原以及脂联素抗体能够用于制备脂联素检测胶乳试剂以及用于脂联素检测试剂盒。为实现上述专利技术目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种脂联素抗原的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：(1.1)脂联素DNA序列获得：通过脂联素表达阳性肿瘤细胞或者化学合成方法制备得到脂联素DNA序列；(1.2)脂联素重组蛋白的制备：将步骤(1)中得到的脂联素DNA序列作为模板克隆到原核细胞或者真核细胞表达载体中，得到脂联素重组蛋白即脂联素抗原。作为优选，所述的步骤(1)中的通过脂联素表达阳性肿瘤细胞制备得到脂联素DNA序列的具体步骤如下：通过免疫印渍方法从肿瘤细胞中筛选脂联素阳性细胞株(1×106表达脂联素的肿瘤细胞)，然后用RNAeasy试剂盒(购自德国Qiagen公司)分离纯化总RNA，经OligodT15引物将总RNA逆转录为cDNA，通过聚合酶链式反应方法从中扩增获得脂联素DNA序列。其核苷酸序列如下所示，记为SEQIDNO.1：5’-atgctgttgctgggagctgttctactgctattagctctgcccgggcatgaccaggaaacc60acgactcaagggcccggagtcctgcttcccctgcccaagggggcctgcacaggttggatg120gcgggcatcccagggcatccgggccataatggggccccaggccgtgatggcagagatggc180acccctggtgagaagggtgagaaaggagatccaggtcttattggtcctaagggagacatc240ggtgaaaccggagtacccggggctgaaggtccccgaggctttccgggaatccaaggcagg300aaaggagaacctggagaaggtgcctatgtataccgctcagcattcagtgtgggattggag360acttacgttactatccccaacatgcccattcgctttaccaagatcttctacaatcagcaa420aaccactatgatggctccactggtaaattccactgcaacattcctgggctgtactacttt480gcctaccacatcacagtctatatgaaggatgtgaaggtcagcctcttcaagaaggacaag540gctatgctcttcacctatgatcagtaccaggaaaataatgtggaccaggcctccggctct600gtgctcctgcatctggaggtgggcgaccaagtctggctccaggtgtatggggaaggagag660cgtaatggactctatgctgataatgacaatgactccaccttcacaggctttcttctctac720catgacaccaactga-3’735。其对应的氨基酸序列如下所示，记为SEQIDNO.2：Adiponectin(N→C)：MLLLGAVLLLLALPGHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGWMAGIPGHPGHNGAPGRDGRDGTPGEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGAYVYRSAFSVGLETYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHITVYMKDVKVSLFKKDKAMLFTYDQYQENNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGEGERNGLYADNDNDSTFTGFLLYHDTN。核苷酸上游引物如下所示，记为SEQIDNO.3：5’-atgctgttgctgggagctgt-3’20。核苷酸下游引物如下所示，记为SEQIDNO.4：5’-tctaccatgacaccaactga-3’20。作为优选，根据Genbank提供的脂联素氨基酸序列，其如SEQIDNO.2所示，通过化学合成脂联素化学合成多肽的三个片段，其氨基酸序列如SEQIDNO.5～7所示。片段1的氨基酸序列如下所示，记为SEQIDNO.5：Fragment-1(N→C)：GEKGEKG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂联素抗原的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：（1.1）脂联素 DNA序列获得：通过脂联素表达阳性肿瘤细胞或者化学合成方法制备得到脂联素 DNA序列；（1.2）脂联素重组蛋白的制备：将步骤（1.1）中得到的脂联素 DNA序列作为模板克隆到原核细胞或者真核细胞表达载体中，得到脂联素重组蛋白即脂联素抗原。

【技术特征摘要】
1.一种脂联素抗原的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：（1.1）脂联素DNA序列获得：通过脂联素表达阳性肿瘤细胞或者化学合成方法制备得到脂联素DNA序列；（1.2）脂联素重组蛋白的制备：将步骤（1.1）中得到的脂联素DNA序列作为模板克隆到原核细胞或者真核细胞表达载体中，得到脂联素重组蛋白即脂联素抗原。2.根据权利要求1所述的一种脂联素抗原的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1.1）中的通过脂联素表达阳性肿瘤细胞制备得到脂联素DNA序列的具体步骤如下：通过免疫印渍方法从肿瘤细胞中筛选脂联素阳性细胞株，然后用RNAeasy试剂盒分离纯化总RNA，经OligodT15引物将总RNA逆转录为cDNA，通过聚合酶链式反应方法从中扩增获得脂联素DNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的一种脂联素抗原的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1.1）中的通过化学合成方法制备得到脂联素DNA序列的具体步骤如下：根据Genbank提供的脂联素氨基酸序列，其如SEQIDNO.2所示，通过化学合成脂联素化学合成多肽的三个片段，其氨基酸序列如SEQIDNO.5~7所示。4.根据权利要求1所述的一种脂联素抗原的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1.2）中以原核细胞生产脂联素重组蛋白的具体方法如下：以步骤（1.1）中获得的脂联素DNA为模板，用聚合酶链式反应将脂联素DNA开放阅读核苷酸序列克隆到原核细胞表达载体pET15b或pET14b的NdeI/BamHI内切酶位点，DNA测序验证后，转化RosettaDE3大肠杆菌，挑选高表达脂联素的细菌克隆，扩大培养至OD值到0.4-0.8时，用1.0mMIPTG在37℃诱导4小时，10000rpm离心15分钟收集细菌沉淀，得到脂联素重组蛋白。5.根据权利要求1所述的一种脂联素抗原的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1.2）中以真核细胞生产脂联素重组蛋白的具体方法如下：以步骤（1.1）中获得的脂联素DNA为模板，克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1，通过物理转染的方法转染工程细胞CHO细胞，5%CO2生物反应器中无血清培养液培养7-10天，收集上清液，浓缩，用AKTA纯化重组蛋白峰并用Lorry’s酚试剂进行蛋白质定量后得到脂联素重组蛋白。6.一种抗脂联素重组蛋白单克隆IgG型抗体制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：（2.1）动物免疫：将权利要求1~4中制得的脂联素重组蛋白以100mg脂联素蛋白/次/只小鼠的浓度与等量的完全福氏佐剂混匀，皮下多点注射免疫Balb/c雌性小鼠(5-6周龄，体重18-20g)，第1次与第2次间隔10-14天，以后每次间隔7天，连续5次，第2-5次脂联素蛋白与等量的不完全福氏佐剂乳化混匀，间隔1周后采用尾静脉/腹腔注射无菌的脂联素蛋白，以加强免疫1次，3天后细胞融合；（2.2）杂交瘤细胞的制备：取步骤（S.1）中的免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按体积比1:6在50%PEG的作用下融合，融合细胞先在次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶选择培养基中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，2周后换为次黄嘌呤-胸腺嘧啶培养基，继续在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养;克隆孔长至1/3-1时，取培养上清液进行抗体检测筛选；（2.3）特异性克隆孔筛选：用50mM的碳酸盐缓冲液稀释脂联素重组蛋白至10mg/mL后，以100mL/...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱永良，陈佳明，程小龙，丁洁，
申请(专利权)人：杭州博谱医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33