瘦素免疫原、杂交瘤细胞、单克隆抗体、多克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种瘦素免疫原、杂交瘤细胞、单克隆抗体、多克隆抗体及应用。该瘦素免疫原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽。由该瘦素免疫原制备得到的抗瘦素的单克隆抗体的特异性较好、灵敏度较高。

Leptin Immunogen, Hybridoma Cells, Monoclonal Antibodies, Polyclonal Antibodies and Their Applications

【技术实现步骤摘要】
瘦素免疫原、杂交瘤细胞、单克隆抗体、多克隆抗体及应用
本专利技术涉及一种瘦素免疫原、杂交瘤细胞、单克隆抗体、多克隆抗体及应用。
技术介绍
瘦素(Leptin)是人的ob基因编码的含有167个氨基酸残基的单链蛋白质，其由脂肪细胞分泌到血浆后，在信号肽酶的作用下除去氨基端的21个氨基酸残基。因此，血浆中存在的瘦素全长为146个氨基酸残基，分子量约为16kDa。瘦素具有较好的亲水性，在血浆中大约80％的瘦素与血浆蛋白质结合，只有少部分以游离形式存在。瘦素通过与广泛存在于中枢神经系统、脂肪、心、肝、肺、肾、胰腺等不同组织和器官的特异性受体和相应的信号传导系统发挥生物效应，参与糖、脂肪和能量代谢的调节。研究发现，在很多生理和病理情况下，人的瘦素水平会发生变化，对许多能量代谢有关疾病的发生、发展、预后和用药疗效检测都具有非常重要的临床指导价值。例如，肥胖者的血清瘦素浓度均高于非肥胖者，因此体内瘦素水平对肥胖的预防和治疗具有一定积极意义；恶性肿瘤患者血清中瘦素水平显著高于正常对照，经治疗后瘦素水平会相应降低，表明瘦素可能作为评价恶性肿瘤患者病情和用药前后疗效监控的指标；在正常妊娠中血清瘦素水平会随妊娠进展逐渐上升，妊娠高血压发生时瘦素水平也呈上升趋势，因此，瘦素对判断妊娠高血压病情具有一定临床价值。总之，瘦素与多种急慢性疾病相关，随着人们对其认识的加深，可以将其更好地应用于临床。目前，瘦素的检测方法主要依赖于瘦素抗体与检测样本中的瘦素的特异性结合能力。因此，抗瘦素抗体的特异性和灵敏度对于瘦素含量的检测十分重要。但是，目前市场上特异性较好、灵敏度较高的抗瘦素抗体还较少，不能满足市场的需求。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种瘦素免疫原，由该瘦素免疫原制备得到的抗瘦素的单克隆抗体的特异性较好、灵敏度较高。此外，还提供一种分泌特异性较好、灵敏度较高的抗瘦素的单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用。一种瘦素免疫原，包括氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽。上述瘦素免疫原包括氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽，由该瘦素免疫原制备得到的抗瘦素的单克隆抗体，能够特异性识别瘦素氨基端的41位～60位氨基酸残基，与瘦素的亲和力和灵敏度较高。在其中一个实施例中，所述瘦素免疫原还包括载体蛋白，所述载体蛋白与所述多肽偶联。一种分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，包括以下步骤：用免疫原免疫动物，得到免疫后的动物的脾细胞，其中所述免疫原为上述瘦素免疫原；将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选得到阳性融合细胞；及对所述阳性融合细胞进行亚克隆，得到所述分泌瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞。一种分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞，由上述分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法制得。一种抗瘦素的单克隆抗体，由上述分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌。一种瘦素免疫原，包括氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的多肽。在其中一个实施例中，所述瘦素免疫原还包括载体蛋白，所述载体蛋白与所述多肽偶联。一种抗瘦素的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：用上述的瘦素免疫原免疫动物，得到所述抗瘦素的多克隆抗体。一种抗瘦素的多克隆抗体，由上述抗瘦素的多克隆抗体的制备方法制得。上述抗瘦素的单克隆抗体和上述抗瘦素的多克隆抗体中的至少一种在制备瘦素检测试剂、制备瘦素检测试纸或制备瘦素检测试剂盒中的应用。一种瘦素检测试剂，包括上述抗瘦素的单克隆抗体和上述抗瘦素的多克隆抗体中的至少一种。一种瘦素检测试剂盒，包括上述瘦素检测试剂。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本专利技术公开内容更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本专利技术一实施方式提供了一种瘦素免疫原，使用该瘦素免疫原制备的杂交瘤细胞分泌的抗瘦素的单克隆抗体能够特异性识别瘦素氨基端的抗原表位，并且与瘦素的亲和力强、灵敏度较高，能够应用于制备瘦素检测试剂、制备瘦素检测试纸、制备瘦素检测试剂盒。具体地，该瘦素免疫原包括氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽。如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列为：RINDISHTQSVSSKQKVTGL。上述瘦素免疫原针对瘦素的氨基端进行设计，如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列与人的瘦素全长氨基酸序列的41位～60位的氨基酸相同，且与瘦素的羧基端距离较大。以包括氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽的上述瘦素免疫原免疫动物后得到的抗体，能够特异性地识别瘦素的氨基端且亲和力强，避免干扰其他抗体识别和结合瘦素的羧基端。在其中一个实施例中，瘦素免疫原还包括载体蛋白，载体蛋白与氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽偶联。载体蛋白与多肽偶联作为免疫原有利于刺激辅助性T细胞，进一步诱导B细胞免疫反应。具体地，载体蛋白选自血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白(OVA)、兔血清白蛋白及纤维蛋白原中的一种。优选地，载体蛋白选自血蓝蛋白及牛血清白蛋白中的一种。本专利技术一实施方式还提供了一种分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，该制备方法步骤S110～步骤S150。步骤S110、用免疫原免疫动物，得到免疫后的动物的脾细胞。具体地，免疫原为上述任一实施例中的瘦素免疫原。进一步地，免疫原包括氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽。在其中一个实施例中，将免疫原与弗式完全佐剂混合并充分乳化后，注射入小鼠体内并不断加强免疫，取血检测血清效价，取效价达到105～106的小鼠的脾脏，得到免疫后的动物的脾细胞。具体地，首次免疫的免疫原的剂量为90μg～120μg，末次免疫的免疫原的剂量为30μg～60μg，免疫的间隔时间为10天～21天。进一步地，首次免疫的免疫原的剂量为100μg～110μg，末次免疫的免疫原的剂量为40μg～50μg，免疫的间隔时间为14天～21天。步骤S130、将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选得到阳性融合细胞。具体地，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，然后经过选择性培养和筛选，得到阳性融合细胞。具体地，利用SEQIDNO.1所示的氨基酸序列筛选分泌抗瘦素抗体的阳性融合细胞。步骤150、阳性融合细胞进行亚克隆，得到所述分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞。具体地，采用有限稀释法进行亚克隆，得到能够稳定分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞。上述分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，采用上述任一实施例的瘦素免疫原作为免疫原免疫动物，得到的杂交瘤细胞能够稳定分泌抗瘦素的单克隆抗体，且该单克隆抗体能够特异性识别瘦素氨基端的表位，对瘦素的亲和力高、特异性高。本专利技术一实施方式还提供了一种分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞。该杂交瘤细胞由上述分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法制得。该杂交瘤细胞分泌出抗瘦素的单克隆抗体记为LEP-Ab-01。其中，LEP-Ab-01能够针对性地识别瘦素的氨基端的表面抗原，具有高亲和力、高特异性。本专利技术还提供一种抗瘦素的单克隆抗体，该单克隆抗体由上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种瘦素免疫原，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种瘦素免疫原，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽。2.根据权利要求1所述的瘦素免疫原，其特征在于，所述瘦素免疫原还包括载体蛋白，所述载体蛋白与所述多肽偶联。3.一种分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：用免疫原免疫动物，得到免疫后的动物的脾细胞，其中所述免疫原为权利要求1或2所述的瘦素免疫原；将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选得到阳性融合细胞；及对所述阳性融合细胞进行亚克隆，得到所述分泌瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞。4.一种分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，由权利要求3所述的分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法制得。5.一种抗瘦素的单克隆抗体，其特征在于，由权利要求4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：周密，林宇剑，钱纯亘，胡鹍辉，
申请(专利权)人：深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44