一种艾本那肽前体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种艾本那肽前体的制备方法。该方法以氨基树脂为原料，先将树脂脱Fmoc保护，再用逐一缩合的方式依次连接带有保护基的氨基酸，直至完成树脂肽直链合成；然后脱除Lys(Mtt)的侧链Mtt保护基，再用逐一缩合的方式依次连接侧链连接剂，得到艾本那肽前体树脂肽。再通过裂解、纯化得到艾本那肽前体及其类似物。本发明专利技术的制备方法工艺稳定、质量可靠、适合规模化生产。

A Method for Preparing the Precursor of Epineptide

【技术实现步骤摘要】
一种艾本那肽前体的制备方法
本专利技术涉及一种用于具有治疗II型糖尿病的长效降糖药物（艾本那肽）生产的艾本那肽前体的制备方法。
技术介绍
根据国际糖尿病联盟估计2009年全球成人糖尿病患者人数约有3.66亿，占全球成人人口的8.3%。其中90～95%是II型糖尿病。预计2030年糖尿病患病人数将增加到5.52亿人，占全球成年人的9.9%。未得到最佳治疗的II型糖尿病可导致多个系统发生并发症，包括可引起心脏病和脑卒中，血脂异常和动脉粥样硬化，晚期病人可出现肾衰竭和眼盲，以及可引起循环功能差、外周缺血和截肢的神经损伤及小血管阻塞。艾本那肽是一种治疗II型糖尿病的长效降糖药物，由常山凯捷健生物药物研发（河北）有限公司开发，其采用了药物亲和力偶合物技术，对GLP-1受体激动剂类药进行合成修饰，使之能与重组人血白蛋白结合而形成的一个全新的稳定的化合物。该化合物进入机体后白蛋白不需要与多肽链分开而直接与GLP-1受体结合产生生物学效应。艾本那肽采用了重组人血白蛋白作为药物载体，重组人血白蛋白对多肽链起到了一个保护免被体内的二肽基肽酶的水解破坏，并避免了肾脏的快速清除，使药物在体内的半衰期明显延长，从而延长了药物在体内的生物学效应时间。在已完成的II型糖尿病患者临床研究中，皮下注射艾本那肽的半衰期是7～10，明显比艾塞那肽的2.4小时长，该药拟采用的临床治疗方案是每周注射一次，会为患者带来极大的使用方便。艾本那肽前体是艾本那肽的关键中间体，是艾本那肽起到降糖作用的活性结构。艾本那肽前体是一个由40个氨基酸组成的多肽。具有如下结构：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(AEEA-MPA)-NH2。其中AEEA为氨基乙氧基-乙氧基-乙酰基；MPA为马来酰亚氨基丙酸，用于与重组人血白蛋白连接；-NH2为C端酰胺。目前，未见关于艾本那肽前体制备方法的报道，需开发出一种工艺稳定且适合规模化生产的艾本那肽前体的制备工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适合于工业化大规模生产艾本那肽前体及其类似物的固相合成方法与纯化方法。本专利技术采用如下技术方案：一种艾本那肽前体或其类似物的制备方法，其包括如下步骤：（1）以氨基树脂为原料，加入脱Fmoc保护剂，脱除树脂上的Fmoc保护基；（2）经步骤（1）处理后的树脂，通过逐一缩合的方式，按照艾本那肽前体或者其类似物的肽序列依次连接带有保护基的氨基酸，缩合反应中加入缩合试剂和有机碱；（3）将步骤（2）得到的树脂进行干燥至恒重；（4）加Mtt保护基脱除试剂至步骤（3）所得树脂中，脱除Lys(Mtt)的侧链Mtt保护基；（5）经步骤（4）处理后的树脂通过逐一缩合的方式，按照顺序将连接剂连接到Lys的侧链上；缩合反应中加入缩合试剂、有机碱，得到艾本那肽前体或其类似物的树脂肽；（6）将树脂肽通过裂解液进行处理，除去树脂和保护基，沉淀离心得到艾本那肽前体或其类似物的粗肽；（7）粗肽经过纯化得到艾本那肽前体或其类似物的精肽。制备方法的步骤（1）中，所述氨基树脂为Ramage树脂。制备方法的步骤（1）中，所述氨基树脂键合量为0.4～0.6mmol/g。制备方法的步骤（1）中，所述脱Fmoc保护剂为哌啶的DMF溶液，哌啶的体积浓度为15%～25%。制备方法的步骤（2）中，所述带有保护基的氨基酸包括：Fmoc-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Boc-His(Boc)-OH、Fmoc-AEEA-OH和MPA。制备方法的步骤（2）中，氨基酸与树脂的投料摩尔比为2∶1～3∶1。制备方法的步骤（2）和（5）中，所述缩合试剂选自1-羟基苯并三唑一水合物、N,N-二环己基碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮中的一种或多种。其中，Met与His的缩合反应中，缩合试剂为3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮。制备方法的步骤（2）和（5）中，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺。制备方法的步骤（2）和（5）中，缩合温度为10～40℃。制备方法的步骤（3）中，所述干燥方法为真空干燥，温度为25～35℃；恒重标准为干燥2小时前后重量变化小于2%。制备方法的步骤（4）中，所述Mtt保护基脱除试剂为三氟乙酸、三乙基硅烷和二氯甲烷组成的混合物，其体积比为1∶2∶97。制备方法的步骤（4）中，所述Mtt保护基脱除试剂与步骤（3）得到的树脂的体积重量比为6～8L∶1kg，优选6.5～7L∶1kg。制备方法的步骤（4）中，所述Mtt的脱除方式为使用Mtt保护基脱除试剂进行脱除反应8次，每次的脱除反应时间为5～30分钟，优选11～15分钟。制备方法的步骤（4）中，Mtt保护基脱除后使用N,N-二异丙基乙胺与二氯甲烷交替对树脂进行清洗。制备方法的步骤（5）中，所述连接剂为Fmoc-AEEA-OH和马来酰亚氨基丙酸。制备方法中，经步骤（5）制备得到的艾本那肽前体或其类似物的树脂肽结构为：Boc-His(Boc)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(Pmc)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(AEEA-MPA)-RamageResin。制备方法的步骤（6）中，所述裂解反应时间为2～5小时，优选为3～4小时。所述裂解液为三氟乙酸、三乙基硅烷、苯甲硫醚和苯酚的混合物，其体积质量比为85L∶5L∶5L∶5kg。制备方法的步骤（6）中，所述裂解液与树脂肽的体积质量比为3～10L∶1kg，优选为6～7L∶1kg。制备方法的步骤（7）中，所述纯化方法为高效液相反向纯化方法，具体包括如下步骤：（a）称取艾本那肽前体粗肽，使用0.1%TFA/H2O溶解。完全溶解后继续搅拌12～24小时后，过滤，上样。（b）使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，收集目标组分。（c）将步骤（b）得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种艾本那肽前体的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：（1）以氨基树脂为原料，加入脱Fmoc保护剂，脱除树脂上的Fmoc保护基；（2）经步骤（1）处理后的树脂，通过逐一缩合的方式，按照艾本那肽前体或者其类似物的肽序列依次连接带有保护基的氨基酸，缩合反应中加入缩合试剂和有机碱；（3）将步骤（2）得到的树脂进行干燥至恒重；（4）加Mtt保护基脱除试剂至步骤（3）所得树脂中，脱除Lys(Mtt)的侧链Mtt保护基；（5）经步骤（4）处理后的树脂通过逐一缩合的方式，按照顺序将连接剂连接到Lys的侧链上；缩合反应中加入缩合试剂、有机碱，得到艾本那肽前体或其类似物的树脂肽；（6）将树脂肽通过裂解液进行处理，除去树脂和保护基，沉淀离心得到艾本那肽前体或其类似物的粗肽；（7）粗肽经过纯化得到艾本那肽前体或其类似物的精肽。

【技术特征摘要】
1.一种艾本那肽前体的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：（1）以氨基树脂为原料，加入脱Fmoc保护剂，脱除树脂上的Fmoc保护基；（2）经步骤（1）处理后的树脂，通过逐一缩合的方式，按照艾本那肽前体或者其类似物的肽序列依次连接带有保护基的氨基酸，缩合反应中加入缩合试剂和有机碱；（3）将步骤（2）得到的树脂进行干燥至恒重；（4）加Mtt保护基脱除试剂至步骤（3）所得树脂中，脱除Lys(Mtt)的侧链Mtt保护基；（5）经步骤（4）处理后的树脂通过逐一缩合的方式，按照顺序将连接剂连接到Lys的侧链上；缩合反应中加入缩合试剂、有机碱，得到艾本那肽前体或其类似物的树脂肽；（6）将树脂肽通过裂解液进行处理，除去树脂和保护基，沉淀离心得到艾本那肽前体或其类似物的粗肽；（7）粗肽经过纯化得到艾本那肽前体或其类似物的精肽。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述氨基树脂为Ramage树脂。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，氨基酸与树脂的投料摩尔比为2∶1～3∶1。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）和（5）中，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）和（5）中，缩合温度为10～40℃；所述缩合试剂选自1-羟基苯并三唑一水合物、N,N-二环己基碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏振兴，孟天行，胡丽英，王莹，张建，白茜茜，楚莎莎，田敬肖，
申请(专利权)人：河北常山生化药业股份有限公司，常山凯捷健生物药物研发河北有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13