一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒，主要采用直接竞争酶联免疫测定法，将以前酶联免疫法中繁琐的操作步骤进行精简、优化，检测快速、灵敏、准确，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒，主要采用直接竞争酶联免疫测定法，将以前酶联免疫法中繁琐的操作步骤进行精简、优化，检测快速、灵敏、准确，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。【专利说明】一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检测试剂盒
本专利技术涉及生化检测
，特别涉及一种海水鱼内生吗啡的检测方法及其检 测试剂盒。
技术介绍
人们通常认为吗啡对高等哺乳动物而言是剧烈的毒品，仅能从植物中提取。但是 经过深入研究表明，在低等软体动物和高等哺乳动物中，除神经肽，氨基酸及其他小分子神 经介质传递机制外，还存在以内生吗啡类物质为介质的神经传递机制。人们的痛觉、精神上 的愉快和抑郁以及生理上的快感，在一定程度上取决于大脑产生内生吗啡的多少，因此，内 生吗啡的产生、增加及减少，在一些特定的情况下对疼痛有着不同的反应和感觉。 之前的研究发现贻贝、龙虾等海洋软体动物神经节自身可产生微量的内生吗啡； 在大白鼠大脑区的杏仁核区内存在内生吗啡，而且内生吗啡可使杏仁核区产生一氧化氮； 在人的白细胞中也能检测到微量的内生吗啡。目前报道用于检测内生吗啡的方法主要高效 液相色谱（HPLC)、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC/MS)。色谱法是目前国际上普遍采用 的检测方法，灵敏度高、准确性好，常作为药物残留检测的确认方法，但其对仪器和操作人 员要求都较高，成本也比较高，一个样品检测要几百元，检测时间也很长，不利于在基层单 位推广使用。免疫分析法是国际上通用的一种生化方法。目前常用的胶体金法受所用的生 物制剂的影响，假阳性出现的概率很高，而且由于胶体金法灵敏度低，颜色判断有人为因素 致使准确性差。 因此建立一种快速、灵敏、准确，并可以大批量应用于内生吗啡检测的方法是具有 非常重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种海水鱼内生吗啡的检测方法，样品前处理过程简单， 能同时快速检测大批样品，主要采用直接竞争酶联免疫测定法，将以前酶联免疫法中繁琐 的操作步骤进行精简、优化，检测快速、灵敏、准确。 本专利技术还提供了一种海水鱼内生吗啡检测试剂盒，试剂盒具有保存时间长、自动 化程度高、成本低、无放射性同位素污染、快速简便、灵敏度高、准确可靠等特点。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是： 一种海水鱼内生吗啡的检测方法，包括以下步骤： (1)样品前处理 取海水鱼的脑部神经节，用甲醇清洗，浙干，然后将脑部神经节撕碎，称取〇. 2±0. 05g 撕碎的脑部神经节，加入0. 5-2ml甲醇，70-75°C水浴2-3小时，冷却至室温，离心，取上清液 于冷冻离心浓缩机中离心直至液体挥发完全，残渣用100-200 μ 1样品稀释液稀释，振荡器 上振荡充分溶解得样品溶液。 现有高效液相色谱的处理样品的方法用于本专利技术的检测样品的处理，无法检测到 内生吗啡，因此，本专利技术首先改进了样品的前处理方法，以适合于下一步的试剂盒的检测。 (2)试剂盒检测 包被有吗啡特异性抗体的酶标板上的微孔编号：将样品和标准品对应微孔按序编号， 每个样品和标准品做两孔平行，并记录样品孔和标准品孔所在位置； 将样品溶液和吗啡标准品溶液均按照每孔20-30 μ 1的量加到对应微孔中，然后加 入吗啡抗原酶标记物100-120 μ 1/孔，室温孵育30-35分钟后倒去孔内液体，用洗涤液 250-300 μ 1/孔洗涤3-5次，加入显色剂100-120 μ 1/孔，室温孵育10-15分钟，然后加终止 液100-120 μ 1/孔终止，酶标仪450nm下测定每孔的吸光度值。 (3)结果分析 以标准品百分吸光率为纵坐标，以吗啡标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图， 将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应 的稀释倍数即为样品中内生吗啡的实际含量。 作为优选，所述样品稀释液为pH7. 4、0. 01mol/L的磷酸盐缓冲液。 作为优选，所述吗啡抗原酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶。 作为优选，所述显色剂为四甲基联苯胺。 作为优选，所述终止液为浓度为2mol/L的硫酸溶液或浓度为2mol/L的氢氧化钠 溶液。 作为优选，包被有吗啡特异性抗体的酶标板制备方法为：用包被缓冲液将吗啡单 克隆抗体稀释至1 μ g/ml得包被液，酶标板每孔加入100 μ 1包被液，37°C孵育2h或者4°C 过夜，倒去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔中加入200 μ 1封闭液，37°C温育2h， 倒去孔内液体，干燥后得包被有吗啡特异性抗体的酶标板。 作为优选，所述洗涤液为含有体积分数0· 5%吐温-20的ρΗ7· 4、0· Olmol/L的磷酸 盐缓冲液稀释10倍后所得。 作为优选，所述包被缓冲液为pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液；所述封闭液为 含有3wt%的聚乙二醇、1 wt %的酪蛋白、4 wt %的甘氨酸、1 wt %的卵清蛋白及1 wt %的 明胶的磷酸盐缓冲液。 作为优选，所述吗啡单克隆抗体的制备方法为： A、 吗啡抗原的合成 称取吗啡原料500mg，加入50mL苯和lg琥珀酸酐，加热回流8h，蒸发除去苯，残留物分 别用无水乙醚、无水乙醇洗涤，然后真空干燥，即得到粉末状的6-琥珀酸-吗啡，称取6-琥 珀酸-吗啡20mg溶于10ml PBS缓冲液中，加入30 μ 1三乙胺，再加入30 μ 1氯甲酸异丁酯， 反应半小时得反应液；称取20mg BSA溶解于10ml PBS缓冲液中，加入上述反应液，搅拌反 应过夜，透析3天，离心，收集上清液，得到吗啡抗原； B、 取6-8周龄雌性BALB/c小鼠六只，将PBS缓冲液与等体积弗氏完全佐剂混合，充 分乳化后，采用腹腔注射的方法进行免疫，按lmg/kg体重的量进行首次免疫，用弗氏不完 全佐剂代替弗氏完全佐剂，采用与首次免疫相同的方法每隔两周加强免疫一次，共加强免 疫四次，从第三次免疫开始，每次免疫后7天，小鼠尾静脉取血lml，进行抗体效价检测，选 择经ELISA检测效价最高的BALB/c小鼠用于制备脾细胞，3天后取效价最高的BALB/c小 鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选获得杂交瘤细胞；另一批BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL 液体石蜡致敏，7-14天后向小鼠腹腔内注射1X106个杂交瘤细胞，7-10天后开始用注 射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1-3天抽取腹水1次，离心，收集上清液，_20°C保存， 进一步采用辛酸-硫酸铵法纯化上清液获得吗啡单克隆抗体。 用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，采用与首次免疫相同的方法每隔两周加强 免疫一次即将PBS缓冲液与等体积弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后，采用腹腔注射的方 法进行免疫，按lmg/kg体重的量进行加强免疫。 根据本专利技术上述方法制备的吗啡单克隆抗体，特异性好，检测效果佳。 一种海水鱼内生吗啡检测试剂盒，包括如下组分： 1、 吗啡标准品溶液，浓度分别为：〇 ng/ml，L25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml，10 ng/ml， 20 ng/ml ； 2、 包被有吗啡特异性抗体的酶标板； 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海水鱼内生吗啡的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）样品前处理取海水鱼的脑部神经节，用甲醇清洗，沥干，然后将脑部神经节撕碎，称取0.2±0.05g撕碎的脑部神经节，加入0.5‑2ml甲醇，70‑75℃水浴2‑3小时，冷却至室温，离心，取上清液于冷冻离心浓缩机中离心直至液体挥发完全，残渣用100‑200μl样品稀释液稀释，振荡器上振荡充分溶解得样品溶液；（2）试剂盒检测包被有吗啡特异性抗体的酶标板上的微孔编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做两孔平行，并记录样品孔和标准品孔所在位置；将样品溶液和吗啡标准品溶液均按照每孔20‑30μl的量加到对应微孔中，然后加入吗啡抗原酶标记物100‑120μl/孔，室温孵育30‑35分钟后倒去孔内液体，用洗涤液250‑300μl/孔洗涤3‑5次，加入显色剂100‑120μl/孔，室温孵育10‑15分钟，然后加终止液100‑120μl/孔终止，酶标仪450nm下测定每孔的吸光度值；（3）结果分析以标准品百分吸光率为纵坐标，以吗啡标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图，将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中内生吗啡的实际含量。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：相兴伟，周宇芳，周利辉，万婧，付万冬，杨会成，郑斌，
申请(专利权)人：浙江省海洋开发研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33