定量检测肠癌中的MDM2基因表达量的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测肠癌MDM2基因表达量的引物探针和方法，包括提取阳性、阴性待测组织样本总RNA并进行cDNA合成，以cDNA为模板对MDM2基因和内参基因进行荧光定量PCR扩增，采用双标准曲线法分析MDM2基因的相对表达量，其中，MDM2基因的特异性引物和探针包括上游引物、下游引物探针序列，以及内参的引物和探针序列。本发明专利技术能够定量检测肠癌组织中的MDM2基因的表达量，提供的检测肠癌MDM2基因表达量的引物和探针特异性强、准确度高、重复性好、灵敏度高，且本发明专利技术提供的方法快速准确、操作简单。操作简单。操作简单。

【技术实现步骤摘要】
定量检测肠癌中的MDM2基因表达量的方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种检测肠癌中MDM2基因表达量的引物和探针、试剂盒以及检测方法，属于基因表达量检测


技术介绍

[0002]肿瘤的发生和发展是多基因交互影响，多环境因素协同作用的结果。鼠双微体基因(Mouse double minute 2，MDM2)是近年来发现的一种与恶性肿瘤密切相关的癌基因，位于染色体12q13
‑
14，编码一个长度为491个氨基酸的蛋白质。
[0003]MDM2基因内主要有两个启动子，分别是p1和p2，p1在编码基因的上游，p2位于第一个内含子中，p53通过p2启动子附近的2个p53结合位点调节MDM2的转录。且MDM2基因具有不同的mRNA剪接形式，目前共发现4个保守区：Ⅰ区是MDM2与p53基因相互结合的部位，包括N端大约100个氨基酸残基，另外还有核定位序列(NLS)和核输出信号(NES)；Ⅱ区为高度酸性区域，能与核糖体L5、L11蛋白以及5S rRNA结合；Ⅲ区含有一个锌指结构，能使细胞由G1期进入S期；Ⅳ区则含有一个环指结构，可介导蛋白质，通过相互作用可参与细胞调控，促进细胞增长。通过上述功能区调节，MDM2可以抑制P53(肿瘤抑制因子)转录活性以及介导其泛素化，也被称为p53的负性调控子，可与p53相互作用形成负反馈环，当MDM2过度表达时会抑制p53的作用，可导致细胞发生转化、增殖以及恶变。不仅如此，MDM2基因的SNP309(rs2279744,T>G)位点的变异可提高MDM2的mRNA和蛋白质的表达水平，从而减弱p53的肿瘤抑制作用。大量研究表明，MDM2基因启动子区域的单核苷酸多态性(SNP)以及MDM2基因扩增是引发MDM2基因异常最终导致恶性肿瘤发生与发展的最主要原因。
[0004]根据目前研究，MDM2基因在恶性肿瘤发生的过程中的具体作用机制尚未完全明确，甚至在某些方面还存在着争议。所以进一步研究该基因与肿瘤的发生、发展及其预后的关系十分关键，为今后肿瘤的诊断、治疗以及预后评估提供新的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种检测肠癌中MDM2基因表达量的引物和探针，还涉及一种包含该引物和探针的试剂盒，以及一种利用该试剂盒定量检测MDM2基因表达量的方法，本专利技术所述检测方法的特异性强、准确度高、操作简单，用以辅助诊断肠癌发生风险。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种检测肠癌中MDM2基因表达量的引物和探针，所述引物为MDM2基因特异性引物，所述特异性正、反向引物和探针序列为：
[0007]MDM2
‑
F：TGCAATACCAACATGTCTGTACCTA；(SEQ ID NO:1)
[0008]MDM2
‑
R：CTTTTTGTGCACCAACAGACTTTAA；(SEQ ID NO:2)
[0009]MDM2
‑
probe：FAM
‑
TGATGGTGCTGTAACCACCTCACAGATTCC
‑
TAMRA；(SEQ ID NO:3)。
[0010]所述探针MDM2
‑
probe的5
’
端标记有FAM发光基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团TAMRA。
[0011]另一方面，本专利技术提供了一种检测肠癌中MDM2基因表达量的试剂盒，包含上述检测肠癌中MDM2基因表达量的引物(MDM2
‑
F和MDM2
‑
R)和探针(MDM2
‑
probe)，含有MDM2基因片段的阳性对照质粒以及含有所Actin基因片段的内参对照质粒。
[0012]进一步地，所述试剂盒还包括THUNDERBIRD Probe qPCR Mix、ROX Reference Dye(50*)、RNase
‑
free ddH2O。
[0013]进一步地，所述试剂盒还包括内参基因引物，其中所述内参基因为Actin，所述内参基因Actin的正、反向引物和探针序列为：
[0014]Actin
‑
F：TGAGCGAGGCTACAGCTT；(SEQ ID NO:4)
[0015]Actin
‑
R：AAATCGTGCGCGACATCAAGGA；(SEQ ID NO:5)
[0016]Actin
‑
probe：FAM
‑
ACCACCACGGCCGAGCGG
–
TAMRA；(SEQ ID NO:6).
[0017]所述探针Actin
‑
probe的5
’
端标记有FAM发光基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团TAMRA。
[0018]更进一步地，所述阳性对照质粒是以pUC57为载体插入MDM2基因片段，所述内参对照质粒是以pUC57为载体插入Actin基因片段。
[0019]另一方面，本专利技术还提供了一种检测肠癌中MDM2基因表达量的方法，包括以下步骤：
[0020](1)提取待测组织样本总RNA并进行cDNA合成；
[0021](2)绘制阳性对照质粒的荧光标准曲线和内参对照质粒的荧光标准曲线；
[0022](3)以cDNA为模板对MDM2基因进行荧光定量PCR扩增，利用第二步中阳性对照质粒的荧光标准曲线和内参对照质粒的荧光标准曲线检测样本中MDM2基因片段的拷贝数。
[0023]其中荧光定量PCR扩增的引物和探针包括MDM2基因特异性引物和探针，所述特异性正、反向引物和探针序列为：
[0024]MDM2
‑
F:TGCAATACCAACATGTCTGTACCTA；
[0025]MDM2
‑
R:CTTTTTGTGCACCAACAGACTTTAA；
[0026]MDM2
‑
probe：FAM
‑
TGATGGTGCTGTAACCACCTCACAGATTCC
‑
TAMRA；所述探针MDM2
‑
probe的5
’
端标记有FAM发光基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团TAMRA。
[0027]进一步地，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：
[0028][0029]进一步地，步骤(2)中检测肠癌中MDM2表达量以内参基因Actin为内参，所述内参基因Actin的正、反向引物和探针序列为：
[0030]Actin
‑
F：TGAGCGAGGCTACAGCTT；
[0031]Actin
‑
R：AAATCGTGCGCGACATCAAGGA；
[0032]Actin
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测肠癌MDM2基因表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、提取待测组织样本总RNA并反转录成cDNA；(2)、绘制阳性对照质粒的标准曲线和内参对照质粒的标准曲线；(3)、以cDNA为模板对MDM2基因进行荧光定量PCR扩增，利用第二步中阳性对照质粒的标准曲线和内参对照质粒的标准曲线检测样本中MDM2基因片段的拷贝数；其中，荧光定量PCR扩增包括检测MDM2和内参Actin的特异性引物和探针，所述检测MDM2基因的特异性正、反向引物和探针序列为：MDM2
‑
F:TGCAATACCAACATGTCTGTACCTA；MDM2
‑
R:CTTTTTGTGCACCAACAGACTTTAA；MDM2
‑
probe：FAM
‑
TGATGGTGCTGTAACCACCTCACAGATTCC
‑
TAMRA；所述检测内参Actin的特异性正、反引物和探针序列为：Actin
‑
F：TGAGCGAGGCTACAGCTT；Actin
‑
R：AAATCGTGCGCGACATCAAGGA；Actin
‑
probe：FAM
‑
ACCACCACGGCCGAGCGG
...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡嘉慧，王淑一，
申请(专利权)人：济南艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：