一种EGFR基因L858R突变的寡核苷酸组合检测方法技术

本发明专利技术公开了一种EGFR基因L858R突变的寡核苷酸组合检测方法，包括以下步骤：(1)提取肺癌组织或血浆样本中的DNA；(2)按总体积20μL配制用于检测L858R突变的实时荧光PCR反应体系，并分装到PCR反应管中；(3)在实时荧光PCR仪上进行扩增，程序为：预变性95℃5分钟，1个循环；扩增95℃30秒，58℃40秒，40个循环；保持4℃。最后根据实时荧光PCR仪显示的Ct值判断检测突变的结果。本发明专利技术采用了改进的寡核苷酸修饰的方法和组合使用寡核苷酸的技术，可以实现血液样本或组织样本中人类EGFR基因L858R突变丰度低至0.1％的突变样本快速检测。丰度低至0.1％的突变样本快速检测。丰度低至0.1％的突变样本快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种EGFR基因L858R突变的寡核苷酸组合检测方法


[0001]本专利技术涉及一种EGFR基因L858R突变的寡核苷酸组合检测方法。

技术介绍

[0002]肺癌是世界上最常见的致死性癌症之一，其发病率和死亡率不断上升，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。其中，非小细胞肺癌(NSCLC)每年约占新诊断肺癌病例的80％，且大多数诊断时已为晚期。过去10年来，化疗被视为晚期NSCLC患者的一线治疗，然而，其高毒性和不良副作用导致临床结果较差，患者平均总生存期(OS)为8
‑
10个月，5年生存率仅为15％。近年来，靶向治疗和个性化药物在NSCLC治疗领域取得重大进展。
[0003]表皮生长因子受体(EGFR)基因位于人类7号染色体的短臂上，包括28个外显子，是ErbB受体TK家族的成员。EGFR过度表达可能导致细胞增殖，促进血管生成，肿瘤侵袭和转移，并抑制细胞凋亡，在NSCLC的发展和进展中发挥重要作用，研究表明EGFR在肿瘤组织，尤其是NSCLC中有独特的表达，是EGFR
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酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)靶向治疗的重要生物标记物，多项临床试验已证实，EGFR基因突变的晚期NSCLC患者能从EGFR
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TKIs治疗中显著获益。
[0004]21号外显子L858R是与EGFR TKI敏感性相关的常见致癌突变，占所有突变的41％，据报道，L858R突变蛋白的激酶活性约为野生型激酶活性的20倍，肺癌细胞中EGFR<br/>‑
L858R突变蛋白的表达增加了癌细胞的侵袭性。FDA/NMPA批准奥希替尼/达可替尼用于携带L858R突变的转移性NSCLC患者一线治疗，因此通过检测EGFR基因L858R突变来准确地预测靶向药物治疗NSCLC患者是临床实践中切实可行的实验诊断方法。
[0005]目前常用的基因突变检测方法主要是测序法和PCR法。测序法成本高，操作复杂，检测时间较长，假阴性率较高；PCR法又包括实时荧光定量PCR(qPCR)、数字PCR(dPCR)和等位基因特异性PCR(AS
‑
PCR/ARMS
‑
PCR)。qPCR灵敏度约为5％，对于血液样本及低突变丰度的肿瘤组织样本存在灵敏度不够的问题；dPCR灵敏度高，但操作成本高，检测通量低；AS
‑
PCR灵敏度约1％，对于如血浆或者血液中的循环肿瘤细胞等肿瘤DNA含量低于1％的样本，AS
‑
PCR法灵敏度不足以进行检测。因此，对于血液样本及低含量样本中检测突变，需要一种灵敏度更高、操作简便、成本更低的检测方法。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的不足，本专利技术在于提供一种检测EGFR基因L858R低频突变(&lt;1％)的核苷酸组合检测方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0008]一种检测EGFR基因L858R突变的引物，引物序列如下所示：
[0009]正向引物：5
’‑
CAGGAACGTACTGGTGAA
‑3’
[0010]反向引物：5
’‑
GCAGCCTGGTCCCTGGTGTC
‑3’
。
[0011]一种检测EGFR基因L858R突变的特异性修饰探针，探针序列如下所示：FAM
‑5’‑
GGC
+GGGCC
‑
BHQ1；其中，FAM代表5,6
‑
FAM荧光修饰基团，BHQ1代表淬灭修饰基团，“+”代表锁核酸修饰碱基。
[0012]一种检测EGFR基因L858R突变的核苷酸结合子(Binder)，核苷酸结合子序列如下所示：5
’‑
ATTTTGGGCTGGCCAAACTGCT
‑3’‑
ddC；其中，3
’
ddC代表双脱氧胞苷修饰。
[0013]一种检测EGFR基因L858R突变的反应体系，包括：PCR酶反应液，L858R正向引物、L858R反向引物，L858R探针，L858R结合子，纯化水，待测模板；
[0014]L858R正向引物：5
’‑
CAGGAACGTACTGGTGAA
‑3’
；
[0015]L858R反向引物：5
’‑
GCAGCCTGGTCCCTGGTGTC
‑3’
；
[0016]L858R探针：FAM
‑5’‑
GGC+GGGCC
‑3’‑
BHQ1；
[0017]核苷酸结合子：5
’‑
ATTTTGGGCTGGCCAAACTGCT
‑3’‑
ddC。
[0018]作为优选，L858R正向引物的反应浓度100
‑
500nM；L858R反向引物的反应浓度100
‑
500nM。
[0019]作为优选，L858R探针的反应浓度为100
‑
500nM；L858R结合子的反应浓度为1000
‑
5000nM。
[0020]作为优选，待测样本DNA的反应浓度为20
‑
50ng。
[0021]一种EGFR基因L858R突变的寡核苷酸组合检测方法，针对L858R突变位点，将修饰性探针以及修饰性结合子这两种寡核苷酸在同一反应中进行组合检测。
[0022]作为优选，首先利用特异性正、反向引物对含有L858R突变的区域进行扩增富集；其次覆盖L858R突变位点的修饰性探针和Binder通过竞争识别突变位点。
[0023]作为优选，所述方法包括以下步骤：
[0024]1)提取肺癌组织或血浆样本中的DNA；
[0025]2)配制用于检测L858R突变的实时荧光PCR反应体系，并分装到PCR反应管中；
[0026]3)在实时荧光PCR仪上进行扩增，程序为：预变性95℃5分钟，1个循环；扩增95℃30秒，58℃40秒，40个循环；保持4℃；根据实时荧光PCR仪显示的Ct值判断检测突变的结果。
[0027]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
[0028]本专利技术采用了改进的寡核苷酸修饰的方法和组合使用寡核苷酸的技术，可以实现血液样本或组织样本中人类EGFR基因L858R突变丰度低于1％的基因突变的快速检测，其优势在于：
[0029](1)灵敏度高，检测下限可达到0.1％；
[0030](2)特异性高，结果为单一阳性信号，易判读；
[0031](3)反应时间短约1小时，操作简单；
[0032](4)基于实时荧光PCR仪，通量大，成本较测序法大大降低，适合临床样本检测；
[0033](5)适用的样本类型广，不局限于高突变的丰度的组织样本或FFPE样本，可拓宽至血液样本。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测EGFR基因L858R突变的引物，其特征是，引物序列如下所示：正向引物：5
’‑
CAGGAACGTACTGGTGAA
‑3’
反向引物：5
’‑
GCAGCCTGGTCCCTGGTGTC
‑3’
。2.一种检测EGFR基因L858R突变的特异性修饰探针，其特征是，探针序列如下所示：FAM
‑5’‑
GGC+GGGCC
‑3’‑
BHQ1。3.一种检测EGFR基因L858R突变的核苷酸结合子，其特征是，核苷酸结合子序列如下所示：5
’‑
ATTTTGGGCTGGCCAAACTGCT
‑3’‑
ddC。4.一种检测EGFR基因L858R突变的反应体系，包括：PCR酶反应液，L858R正向引物、L858R反向引物，L858R探针，L858R结合子，纯化水，待测模板；L858R正向引物：5
’‑
CAGGAACGTACTGGTGAA
‑3’
；L858R反向引物：5
’‑
GCAGCCTGGTCCCTGGTGTC
‑3’
；L858R探针：FAM
‑5’‑
GGC+GGGCC
‑3’‑
BHQ1；核苷酸结合子：5
’‑
ATTTTGGGCTGGCCAAACTGCT
‑3’‑
ddC。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈谦，曹又元，刘弘扬，刘泓，王聪，刘斯渺，
申请(专利权)人：苏州索真生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：