本发明专利技术涉及生物医学技术领域，提供了一种检测MPN变异位点的试剂盒及检测方法，试剂盒包括用于对样本基因组DNA进行多重PCR构建文库的试剂包、用于对文库样本进行测序的测序设备、用于对文库样本测序结果进行数据分析的数据分析软件、用于对变异检测数据进行注释的注释软件和用于注释的变异位点注释数据库，试剂包包括用于扩增CARL、JAK2、MPL和CSF3R基因突变位点的引物组合，所述引物组合包括正向引物和反向引物。通过设计引物组合A和引物组合B，一次性准确检测多个基因的热点突变区域，检测效率高、检测周期短；本发明专利技术整体相对于现有技术中一代测序对MPN的检测准确，弥补一代测序中存在未检出的缺陷，能够快速确定突变基因、突变位点及突变频率。突变位点及突变频率。突变位点及突变频率。
【技术实现步骤摘要】
一种检测MPN变异位点的试剂盒及检测方法
[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及了一种检测MPN变异位点的试剂盒及检测方法。
技术介绍
[0002]骨髓增殖性肿瘤(MPN)是以骨髓中分化成熟相对正常的一系或多系髓系(粒系、红系、巨核系)细胞持续异常增殖为特征的一组克隆性造血干细胞疾病大多数真性红细胞增多症(PV)患者有Janus蛋白酪氨酸激酶
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2基因(JAK2)的体细胞突变。该突变在血液髓系细胞中可检测到。该突变造成JAK2负调节区域功能的缺失，从而导致JAK2持续性活动性增强。最常见的是JAK2 V617F突变，几乎所有的PV患者都可见JAK2 V617F突变；少部分PV患者有JAK2的其他位点突变(如第12外显子)。
[0003]目前已发现与MPN相关的分子标志物主要有JAK2，CARL、CSF3R及MPL等。2005年发现该类疾病中JAK2基因获得性突变
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JAK2V617F点突变，该突变被证实在MPN中具有重要的诊断及预后意义。超过90％的PV患者及约60％的ET和PMF患者均具有V617F点突变。除此以外，近年来多项研究表明在JAK2V617F突变呈阴性的MPN病人中发现MPL突变及体细胞钙网蛋白(CALR)突变。如MPL515位点的突变，CALR 9号外显子的移码突变等。
[0004]对MPN进行多基因检测对于其诊断、进一步危险分层以及最终实现更为精确的个体化治疗显得尤为重要。目前检测MPN相关基因突变的方法主要有直接测序，等位基因特异性PCR(AS
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PCR)，高分辨率溶解曲线(HRMA)等。AS
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PCR方法是根据突变位点设计特异性引物进而通过PCR检测基因突变，一般适用于点突变，如JAK2V617F的检测。HRMA方法曾被报道用来检测MPN病人中CALR的基因突变，并被证实具有较高的灵敏度。然而，由于AS
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PCR，HRMA只适合少数的突变类型的检测，当临床病人需要检测较多相关的基因突变时，此类方法不能够满足检测要求。而直接测序的方法能够对需要检测样本的相关基因序列进行精确测序，从而分析相关基因是否发生突变，具有简便、准确且适合批量操作的特点。目前有不少关于直接测序检测MPN相关基因突变的报道，然而往往由于引物特异性不是很好，造成测序峰图有较高背景峰，从而对突变的判断造成一定困难；同时PCR方法不能直观地得到具体的突变序列，而一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域。
技术实现思路
[0005]针对现有技术中MPN检测方法的不足和实际需求，本专利技术提供了一种检测MPN变异位点的试剂盒及检测方法，解决了现有技术中MPN检测周期长，不能快速确定致病基因突变位点的问题。
[0006]本专利技术提供了一种检测MPN变异位点的试剂盒，所述试剂盒包括用于对样本基因组DNA进行多重PCR构建文库的试剂包、用于对文库样本进行测序的测序设备、用于对文库样本测序结果进行数据分析的数据分析软件、用于对变异检测数据进行注释的注释软件和
用于注释的变异位点注释数据库。
[0007]进一步，所述试剂包包括用于扩增CARL、JAK2、MPL和CSF3R基因突变位点的引物组合，所述引物组合包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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SEQ ID NO.19所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.20
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SEQ ID NO.38所示。
[0008]进一步，所述引物组合包括引物组合A和引物组合B；
[0009]所述引物组合A中正向引物的核苷酸序列为：
[0010][0011][0012]所述引物组合A中反向引物的核苷酸序列为：
[0013]编号基因反向序列No1CALRCAGGCCAAGGACGAGCTGTAGNo2CALRCTTAAGGAAACCCAGCAGTGGTNo3CALRAGGCCTGAGATTTCATCTGCTCTNo4CALRTGAGATTTCATCTGCTCTCCTTCC
No5CALRGAAGCCACAGGCCTGAGATTTCNo6CALRAGCCACAGGCCTGAGATTTCATCTGNo7CALRCCTGGGGGGCAGTGGTGTNo10CSF3RGGAGATGCTGGTGACTGGAGATGNo11CSF3RCATAAAGGACCTGATCGCTGGTNo12CSF3RTGGTGGAACACAAAGGGTACCACTNo16JAK2TGTCCTTTTAAAACAACATCTGTTTTCTTGNo17JAK2TACTTGGGCAGTGGTGTAAAGGNo19MPLAGGCATTCTTGGTTCGCTCTGTGAC
[0014]；
[0015]所述引物组合B中正向引物的核苷酸序列为：
[0016]编号基因正向序列No13CSF3RAGCCTATGGAGATTGGGAGGAGAGNo14CSF3RTGGAGTCACAGCGGAGATAGTGNo15CSF3RTACCCTCCAAACAGCCATCTCTNo18JAK2TGCTGAAAGTAGGAGAAAGTGCATCTNo8CALRTGAGGAGGATGAGGAGGACAAGGANo9CALRTCATCTCTTAGCTCCCCTCCAAC
[0017]；
[0018]所述引物组合B中反向引物的核苷酸序列为：
[0019]编号基因反向序列No13CSF3RCAAAGACACAGTCGTCCTCCTNo14CSF3RTGGTGATGGGTGGCGTGCCAANo15CSF3RCAGCATAGGCCTGGATGGTAAAGCTNo18JAK2TAATGCCTTTCTCAGAGCATCTGTNo8CALRCCTCCACTCTCCCCCACCNo9CALRCCCAGATTGGCTCACACTGAGA
[0020]。
[0021]进一步，所述数据分析软件包括质控软件、比对软件和变异检测软件；
[0022]所述质控软件用于对原始测序信号文件的数据进行质控处理，形成有效测序数据；
[0023]所述比对软件用于将有效测序数据比对到人类hg19参考基因组得到比对数据；
[0024]所述变异检测软件用于对比对数据进行变异检测得到变异检测数据；
[0025]进一步，所述注释软件为ANNOVAR软件。
[0026]进一步，所述变异位点注释数据库包括第一数据库和第二数据库，所述第一数据库包括1000Genoms数据库、gnomAD数据库、ExAC数据库、SIFT数据库、Polyphen2数据库、Mutationtaster数据库、COSMIC数据库、ClinVar数据库、OMIM数据库和HGMD数据库，所述第二数据库包括用于解读MPN相关基因的蛋白功能和临床意义的MPN基因数据库和用于解读检测到的热点突变临床意义的MP本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测MPN变异位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于对样本基因组DNA进行多重PCR构建文库的试剂包、用于对文库样本进行测序的测序设备、用于对文库样本测序结果进行数据分析的数据分析软件、用于对变异检测数据进行注释的注释软件和用于注释的变异位点注释数据库。2.根据权利要求1所述的一种检测MPN变异位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂包包括用于扩增CARL、JAK2、MPL和CSF3R基因突变位点的引物组合，所述引物组合包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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SEQ ID NO.19所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.20
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SEQ ID NO.38所示。3.根据权利要求2所述的一种检测MPN变异位点的试剂盒，其特征在于，所述引物组所述合包括引物组合A和引物组合B；所述引物组合A中正向引物的核苷酸序列如下：所述引物组合A中反向引物的核苷酸序列如下：
所述引物组合B中正向引物的核苷酸序列如下：所述引物组合B中反向引物的核苷酸序列如下：所述引物组合B中反向引物的核苷酸序列如下：4.根据权利要求3所述的一种检测MPN变异位点的试剂盒，其特征在于，所述数据分析软件包括质控软件、比对软件和变异检测软件；
所述质控软件用于对原始测序信号文件的数据进行质控处理，形成有效测序数据；所述比对软件用于将有效测序数据比对到人类hg19参考基因组得到比对数据；所述变异检测软件用于对比对数据进行变异检测得到变异检测数据；5.根据权利要求4所述的一种检测MPN变异位点的试剂盒，其特征在于，所述注释软件为ANNOVAR软件。6.根据权利要求5所述的一种检测MPN变异位点的试剂盒，其特征在于，所述变异位点注释数据库包括第一数据库和第二...
【专利技术属性】
技术研发人员：汝昆，陈龙，蔺亚妮，
申请(专利权)人：天津见康华美医学诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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