肾透明细胞肉瘤的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于医学辅助诊断领域，具体涉及肾透明细胞肉瘤的检测试剂盒。本发明专利技术的肾透明细胞肉瘤的检测试剂盒，包含上游引物和下游引物。本发明专利技术以BCOR ITD作为CCSK诊断标志物，开发可检测BCOR

【技术实现步骤摘要】
肾透明细胞肉瘤的检测试剂盒


[0001]本专利技术属于医学辅助诊断领域，具体涉及肾透明细胞肉瘤的检测试剂盒。

技术介绍

[0002]肾透明细胞肉瘤(Clear Cell Sarcoma of Kidney，CCSK)是儿童第二常见的肾脏恶性肿瘤，占所有儿童原发肾肾脏肿瘤的4
‑
6％，大部分发生在2
‑
4岁内，男女性别比2:1，易发生骨、肺和脑转移。由于该肿瘤缺乏特异的临床表现和影像学特征，临床诊断困难，病理检查是诊断的金标准，但是CCSK病理形态不特异，易与肾母细胞瘤、恶性横纹肌样瘤等混淆，容易误诊和漏诊，亟需开发特异性诊断方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种肾透明细胞肉瘤中BCOR ITD的检测试剂盒。
[0004]根据本专利技术具体实施方式的肾透明细胞肉瘤的检测试剂盒，所述试剂盒包含上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列为：
[0005]SEQ ID NO.1：5
’‑
GTCCTCCCGCATATTTCGC
‑3’
；
[0006]SEQ ID NO.2：5
’‑
TTGTCACCATTGCAGAGG
‑3’
；
[0007]下游引物的核苷酸序列为：
[0008]SEQ ID NO.3：5
’‑
TGACACATATGCACAAGGAT
‑3’
。
[0009]本专利技术选择CCSK中的存在BCOR基因内部串联重复(Internal Tandem Duplication，ITD)，针对性的选择靶基因，设计筛选引物序列，扩增所得ITD片段仅存在于肾透明细胞肉瘤中，不存在于其他类型的肾脏肿瘤中，具有高度特异性。
[0010]根据本专利技术具体实施方式的肾透明细胞肉瘤的检测试剂盒，所述试剂盒还包括2
×
PremixTaq 2.0plus dye和去离子水。
[0011]根据本专利技术具体实施方式的肾透明细胞肉瘤的检测试剂盒，2
×
PremixTaq2.0plus dye使用的体积为12.5μl。
[0012]根据本专利技术具体实施方式的肾透明细胞肉瘤的检测试剂盒，去离子水使用的体积为9.5μl。
[0013]根据本专利技术具体实施方式的肾透明细胞肉瘤的检测试剂盒，上游引物使用的体积为1μl。
[0014]根据本专利技术具体实施方式的肾透明细胞肉瘤的检测试剂盒，下游引物使用的体积为1μl。具体的，PCR反应体系为
[0015]试剂体积(μl)Mix12.5模板DNA1上游引物1下游引物1
去离子水9.5总体积25
[0016]PCR扩增条件为：(1)98℃预变性30s；(2)98℃变性10s；(3)60℃退火30s；(4)72℃延伸30s；(5)2
‑
4步骤循环40次；(6)72℃延伸10min。
[0017]结果判定方法为：野生型BCOR基因扩增片段为303bp(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3引物组合)或262bp(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3引物组合)，如果存在更大分子量条带，则说明在肿瘤组织存在BCOR ITD；如果无，则说明不存在BCOR ITD。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术以BCOR
‑
ITD作为CCSK诊断标志物，开发可检测BCOR
‑
ITD的引物序列试剂盒，通过检测BCOR
‑
ITD在CCSK肿瘤中的状态，实现对儿童肾脏肿瘤的精准诊断鉴别诊断和预后判断。
[0020]本专利技术操作简单易于推广，检测利用患者活检或手术样本，无需患者受二次有创伤害。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1显示引物筛选比较结果，其中，maker为250和500；
[0023]图2显示5例CCSK患者组织DNA的PCR鉴定结果，其中，maker为250和500；
[0024]图3显示阳性PCR产物经Sanger测序验证的结果；
[0025]图4显示实施例5中特异性和灵敏度检测结果。
具体实施方式
[0026]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。
[0027]实施例1检测肾透明细胞肉瘤BCOR基因内部串联重复的专用引物
[0028]本专利技术设计3对引物用于扩增BCOR ITD序列，引物序列分别为：
[0029]F1：5
’‑
GTCCTCCCGCATATTTCGC
‑3’
；
[0030]F2：5
’‑
TTGTCACCATTGCAGAGG
‑3’
；
[0031]F3：5
’‑
GACCTGGAAGCCTTCAACCC
‑3’
[0032]R：5
’‑
TGACACATATGCACAAGGAT
‑3’
；
[0033]R2：5
‘‑
GTACATGGTGGGTCCAGCTTG
‑3’
；
[0034]结果如图1所示，引物对F1R和引物对F2R均扩增出分子量更大的ITD产物，引物对F3R2组合无法扩增得到ITD序列，扩增失败。
[0035]在此基础上，本专利技术考虑石蜡组织受标本制作和蜡块保存年限影响，DNA质量较
差，经测试保存一两年以上的标本中DNA降解严重，分子量经常降解至200
‑
300bp及以下，限制了扩增片段的大小。BCOR ITD序列集中在15号外显子，多数在60
‑
150bp范围内，个别大于200bp。扩增片段越长，覆盖度越高，但是对样本DNA质量要求亦增加。为了尽可能涵盖更多的ITD类型，增加检测试剂盒准确性，本专利技术最终选择两条上游引物，形成两组引物对，扩增得到两组分子量大小不同的扩增引物，
[0036]从而，本专利技术确定的BCOR
‑
ITD引物序列如下：
[0037]F1:(上游引物1)：5
’‑
GTCCTCCCGCATATTTCGC
‑3’
；
[0038]F2:(上游引物2)：5
’‑
TTGTCACCATTGC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.肾透明细胞肉瘤的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1：5
’‑
GTCCTCCCGCATATTTCGC
‑3’
；SEQ ID NO.2：5
’‑
TTGTCACCATTGCAGAGG
‑3’
；下游引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.3：5
’‑
TGACACATATGCACAAGGAT
‑3’
。2.权利要求1所述的肾透明细胞肉瘤的检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：何乐建，张朦，于永波，姚兴凤，郭永丽，贾超，管晓星，王建文，张汝倩，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京儿童医院，
类型：发明
国别省市：