检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针、其制备方法和使用方法技术

本发明专利技术提供一种检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针、其制备方法和使用方法，CDKN2C和FAF1基因是1p32片段丢失中100％相应整体染色体丢失的片段，因此对于1p32位置的检测需设计互补的基因片段涵盖两者的转录起始范围，通过分析1p32位置的基因片段，选取了CDKN2C和FAF1的转录起始各2个外显子区域间外加上下游20bp的部位，设计合成了相应荧光探针用于检测分析。同时，本发明专利技术利用了1p染色体位置的中心着丝粒用于染色体拷贝数变异数目的参考，结合本发明专利技术提供的实验技术方法，该探针能够快速准确的检测1p32位置的染色体拷贝数变异情况，判断1p32位置染色体拷贝数扩增或丢失的情况。失的情况。失的情况。

【技术实现步骤摘要】
检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针、其制备方法和使用方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针、其制备方法和使用方法。

技术介绍

[0002]本部分提供的仅仅是与本公开相关的背景信息，其并不必然是现有技术。
[0003]1号染色体短臂末端集中了高密度的与细胞生长、增殖、分化相关的基因，胶质瘤1号染色体短臂(1p)染色体的缺失与预后不佳有关。若存在1号染色体短臂和19号染色体长臂同时丢失的情况则提示预后良好。
[0004]市场上目前主要的检测方法有荧光原位杂交(FISH)和二代测序(NGS)等。荧光原位杂交技术是一种常用的非放射性原位杂交技术，利用生物素、地高辛等报告分子标记核酸探针后，通过探针与染色体上的靶DNA的同源互补，检测靶DNA与核酸探针的杂交体的技术手段。形成杂交体的报告分子荧光素标记的特异亲和素产生免疫化学反应，由荧光检测体系在镜下可对DNA进行定性、定量或相对定位分析，相比于二代测序具有费用低、检测快、定位准确等优点。
[0005]市面上已有的1p染色体缺失的检测是利用原位杂交荧光探针对1p上的局部位点1p36检测的，但需要结合19q的位置判断1p/19q的缺失情况。

技术实现思路

[0006]鉴于上述问题，本专利技术的第一方面提出了一种检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针的制备方法，包括：
[0007]使用缺口平移法标记CDKN2C和FAF1的转录起始各2个外显子区域间外加上下游20bp的部位，准备0.1mmol/L dNTP、0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等体积混合，准备0.1mmol/L dTTP 1倍体积的0.3mmol/L dTTP和2倍体积的三蒸水混合，通过以下反应体系进行缺口平移实验0.1mmol/L dTTP 6.5μl、0.1mmol/L dNTP 10μl、10
×
Nick Translation buffer 5μl、1mmol/L DIG
‑
11
‑
dUTP/Biotin
‑
16
‑
dUTP 0.5μl、Nick Translation Enzyme 10μl、DNA(1μg)Xμl、H2O 18
‑
Xμl，in total 50μl；
[0008]采用凝胶电泳法判断所述探针的大小，将EP管置于冰上，取其中5μl于70℃加热5分钟后行2％琼脂糖凝胶电泳以观察所述探针的大小，根据所述探针为单一序列探针的大小为200
‑
600bp，确定所述探针大小合适；根据所述探针偏大，在15℃延长反应10
‑
30分钟，再重复进行凝胶电泳，直至所述探针的大小为200
‑
600bp；向反应体系中加入1μl 0.5M EDTA和/或70℃加热5分钟，以灭活酶，所述探针于
‑
20℃保存备用。
[0009]CDKN2C和FAF1基因是1p32片段丢失中100％相应整体染色体丢失的片段，因此对于1p32位置的检测需设计互补的基因片段涵盖两者的转录起始范围，通过分析1p32位置的基因片段，选取了CDKN2C和FAF1的转录起始各2个外显子区域间外加上下游20bp的部位，设
计合成了相应荧光探针用于检测分析。同时，本专利技术利用了1p染色体位置的中心着丝粒用于染色体拷贝数变异数目的参考，结合本专利技术提供的实验技术方法，该探针能够快速准确的检测1p32位置的染色体拷贝数变异情况，判断1p32位置染色体拷贝数扩增或丢失的情况。
[0010]本专利技术着眼于胶质瘤1p染色体位置上染色体部分缺失的特点，通过筛选发现了1p32位置独立于原先传统1p36位置判定的特殊价值，提供了一种对应的探针并提供了相应制备和使用方法和统计判定方法。
[0011]在TCGA的数据库中显示，1p32的丢失和1p36并不完全重叠，彼此之间存在相应的差集，同时1p32的丢失显示独立于1p36的预后影响。因此对于1p32染色体缺失的检测在胶质瘤中具有重要的诊断和检测价值。现有的市面对于1p染色体的判断使用的是1p36位点的检测Kit，本专利技术借助FISH探针的技术，根据基因位点设计开发了相应探针，补充了胶质瘤染色体拷贝数变异的检测办法，具有较强的推广的应用价值。
[0012]在本专利技术的一些实施例中，所述反应体系用于标记1μgDNA，当需要标记更多量的DNA时，试剂量和反应体系相应等倍扩大。
[0013]在本专利技术的一些实施例中，各成分混匀后短时离心，对于≤10kb的质粒，于15℃反应3.5小时，对于BAC/PAC，于15℃反应9小时。
[0014]本专利技术的第二方面提出了一种检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针，通过上述技术方案所述的检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针的制备方法制备得到。
[0015]本专利技术实施例的检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针与上述实施例中的检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针的制备方法所具有的有益效果相同，在此不再赘述。
[0016]本专利技术的第三方面提出了一种检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针的使用方法，使用上述技术方案所述的检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针，包括：
[0017]制备实验溶液；
[0018]对组织样本进行预处理；
[0019]使用探针检测所述组织样本。
[0020]本专利技术实施例的检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针与上述实施例中的检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针的制备方法所具有的有益效果相同，在此不再赘述。
[0021]在本专利技术的一些实施例中，所述制备实验溶液包括：
[0022]制备NaOH溶液：a)用天平称取4克分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中；b)用200ml量筒准确取100ml蒸馏水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中；c)摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解；d)然后缓缓倾倒入250ml广口瓶中，密封保存备用；
[0023]制备20XSSC溶液:取氯化钠175.5g和柠檬酸三钠88.2g，加入1000ml双蒸水中，用磁力搅拌棒搅拌，使其完全溶解，用滤纸过滤，调pH为5.3，封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月；
[0024]制备2XSSC溶液:用20
×
SSC和双蒸水，按1:9的比例稀释，调pH为7.0,封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月；
[0025]制备2
×
SSC/0.1％NP
‑
40：
[0026]50ml 20
×
SSC(pH5.3)
[0027]0.5ml NP
‑
40
[0028]449.5ml双蒸水
[0029]配成500ml，调pH为7.0，封口膜封好，室温保存备用，有效期6个月；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针的制备方法，其特征在于，包括：使用缺口平移法标记CDKN2C和FAF1的转录起始各2个外显子区域间外加上下游20bp的部位，准备0.1mmol/L dNTP、0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等体积混合，准备0.1mmol/L dTTP 1倍体积的0.3mmol/L dTTP和2倍体积的三蒸水混合，通过以下反应体系进行缺口平移实验0.1mmol/L dTTP 6.5μl、0.1mmol/L dNTP 10μl、10
×
Nick Translation buffer 5μl、1mmol/L DIG
‑
11
‑
dUTP/Biotin
‑
16
‑
dUTP 0.5μl、Nick Translation Enzyme 10μl、DNA(1μg)Xμl、H2O18
‑
Xμl，in total 50μl；采用凝胶电泳法判断所述探针的大小，将EP管置于冰上，取其中5μl于70℃加热5分钟后行2％琼脂糖凝胶电泳以观察所述探针的大小，根据所述探针为单一序列探针的大小为200
‑
600bp，确定所述探针大小合适；根据所述探针偏大，在15℃延长反应10
‑
30分钟，再重复进行凝胶电泳，直至所述探针的大小为200
‑
600bp；向反应体系中加入1μl 0.5M EDTA和/或70℃加热5分钟，以灭活酶，所述探针于
‑
20℃保存备用。2.根据权利要求1所述的检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针的制备方法，其特征在于，所述反应体系用于标记1μgDNA，当需要标记更多量的DNA时，试剂量和反应体系相应等倍扩大。3.根据权利要求1或2所述的检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针的制备方法，其特征在于，各成分混匀后短时离心，对于≤10kb的质粒，于15℃反应3.5小时，对于BAC/PAC，于15℃反应9小时。4.一种检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针，其特征在于，通过权利要求1
‑
3任一项所述的检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针的制备方法制备得到。5.一种检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针的使用方法，使用权利要求4所述的检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针，其特征在于，包括：制备实验溶液；对组织样本进行预处理；使用探针检测所述组织样本。6.根据权利要求5所述的检测胶质瘤染色体位点1P32缺失的探针的使用方法，其特征在于，所述制备实验溶液包括：制备NaOH溶液：a)用天平称取4克分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中；b)用200ml量筒准确取100ml蒸馏水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中；c)摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解；d)然后缓缓倾倒入250ml广口瓶中，密封保存备用；制备20XSSC溶液:取氯化钠175.5g和柠檬酸三钠88.2g，加入1000ml双蒸水中，用磁力搅拌棒搅拌，使其完全溶解，用滤纸过滤，调pH为5.3，封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月；制备2XSSC溶液:用20
×
SSC和双蒸水，按1:9的比例稀释，调pH为7.0,封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月；制备2
×
SSC/0.1％NP
‑
40：50ml 20
×
SSC(pH5.3)0.5ml NP
‑
40449.5ml双蒸水
配成500ml，调pH为7.0，封口膜封好，室温保存备用，有效期6个月；制备系列酒精：取无水乙醇28ml和34ml，分别与12ml和6ml双蒸水混合，配成70％和85％的酒精，与无水乙醇共同组成70％，85％，100％的系列酒精，封口膜封好，室温保存备用，另配制一上述系列酒精，封口膜封好，
‑
20℃室温保存备用；制备PBS缓冲液:PBS1 L配方(pH7.4)：磷酸二氢钾...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨辉，庄骐源，刘颖，陈亮，毛颖，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：