一种检测Tim-3的ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测Tim-3蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法。本发明专利技术还公开了所述ELISA试剂盒中抗人Tim-3中和性单克隆抗体L3C的序列及制备过程，本发明专利技术还公开了检测人Tim-3蛋白的ELISA试剂盒的特异性和灵敏度。本发明专利技术公开的检测Tim-3蛋白的ELISA试剂盒能够准确检测出样品中Tim-3的含量，其灵敏度达到1ng/ml。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测Tim-3蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法。本专利技术还公开了所述ELISA试剂盒中抗人Tim-3中和性单克隆抗体L3C的序列及制备过程，本专利技术还公开了检测人Tim-3蛋白的ELISA试剂盒的特异性和灵敏度。本专利技术公开的检测Tim-3蛋白的ELISA试剂盒能够准确检测出样品中Tim-3的含量，其灵敏度达到1ng/ml。【专利说明】—种检测Tim-3的ELISA试剂盒
本专利技术涉及一种ELISA试剂盒，具体而言涉及检测人Tim-3的ELISA试剂盒，还涉及该ELISA试剂盒中Tim-3单克隆抗体的制备和试剂盒的使用方法。
技术介绍
Tim-3在结构上属于T细胞免疫球蛋白及粘蛋白(T cell Immunoglobulindomainand Mucin domain protein, Tim)家族成员。由于Tim家族广泛参与了机体的免疫调节过程，其功能正日益受到人们的重视。Tim-3特异性表达于活化的Thl、Thl7效应细胞表面，而不表达于Th2细胞。现已知半乳糖结合蛋白-9 (Galectin-9, Gal-9)为Tim_3的天然配体，该分子广泛表达于外周免疫系统，Gal-9与Thl、Thl7细胞上的Tim_3分子特异性结合，可引发后者的调亡，下调免疫反应，诱导免疫耐受。除了膜结合形式的Tim-3分子，可溶性的Tim-3分子是否，以及如何影响免疫调节过程是目前尚不清楚的内容。目前，研究证实Tim-3分子主要通过调节不同CD4+ T细胞亚群的功能广泛参与了自身免疫病、移植排斥、抗感染等免疫应答过程。目前的研究证实Tim-3表达的异常与许多疾病有密切的关系，如研究发现HIV，HCV感染的患者以及一些肿瘤患者，其T细胞上Tim-3表达升高，由于Tim-3能介导T效应细胞的调亡，传递负性调节信号，可导致机体的免疫功能瘫痪。任何阻断Tim-3/Gal-9结合的因素均可以使Thl、Thl7细胞避开死亡，增强T效应细胞的活性，恢复免疫功能。一方面，在一些自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘等疾病中，由于Gal-9或Tim-3表达的升高，导致Thl细胞的功能受到抑制，进而打破体内的免疫平衡，引起病理性的Th2细胞的活性增强，导致疾病的发病。在这种情况下，任何阻断Tim-3/Gal-9结合的因素均能有利于体内免疫平衡的恢复，缓解疾病的进程。如给哮喘模型动物注射抗Tim-3抗体或重组Tim-3融合蛋白均能通过阻断Tim-3/Gal_9结合，增强Thl细胞活性，纠正由Th2细胞介导的哮喘症状，恢复体内Thl/Th2细胞平衡。另一方面，在一些自身免疫病如炎性肠病以及I型糖尿病模型中，研究发现阻断Tim-3的活性增强了体内Thl效应细胞的功能，进一步加重了自身免疫损伤，该结果再次证明Tim-3在体内免疫平衡的维持中发挥重要作用。上述研究资料表明，Tim-3通路具有重要的免疫调节功能，其表达的异常与多种疾病的发生、发展有密切关系。尽管研究表明Tim-3的中和抗体也在一些疾病模型中发挥了很好的干预作用，但目前国内外尚没有上市的Tim-3抗体，因此建立和发展具有自主知识产权的以抗体为基础的检测和诊治用品，对于多种相关性疾病的干预具有重要的现实意义。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术公开了一种检测Tim-3蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法，所述试剂盒能够准确检测出样品中的Tim-3蛋白含量。本专利技术还公开了试剂盒中抗Tim-3抗体的序列及其制备方法。本专利技术公开了一种抗人Tim-3的单克隆抗体L3C，所述单克隆抗体包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID N0:U SEQ ID NO:2所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。本专利技术所述的单克隆抗体的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1、⑶R2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。所述单克隆抗体的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中 SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10 所示。本专利技术还公开了上述单克隆抗体L3C的制备方法，主要包括如下:1.抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建首先，原核表达人Tim-3蛋白，免疫Balb/c小鼠，用常规方法进行细胞融合。用间接ELISA法筛选阳性细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100%阳性。对杂交瘤细胞L3C进行了染色体核型分析，杂交瘤细胞L3C染色体平均数目为106条，用双相琼脂扩散实验证明L3C杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a。2.杂交瘤细胞L3C轻、重链基因的钓取提取中和性单克隆抗体L3C细胞的RNA，经RT-PCR，用特异性引物钓取抗体的轻重链基因。常规法连接入载体，转化感受态细菌，培养后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定后进行DNA测序分析。通过上述步骤，构建了含有人Tim-3中和抗体L3C轻、重链基因的载体，经序列分析、比对，编码序列为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因，其氨基酸序列分别为SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2o 3.单克隆抗体L3C轻、重链可变区基因序列和氨基酸序列的确定用WWW.expasy.0rg在线软件将编码人Tim_3中和性单克隆抗体L3C的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，单克隆抗体L3C的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。根据Kabat数据库确定轻链可变区序列中的互补决定区CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6和SEQ ID N0:7所示。重链可变区序列中的互补决定区⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。本专利技术应用一套设计的引物成功地从培养的人Tim-3中和性单克隆抗体L3C杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因。所得轻链和重链可变区基因可编码正确的小鼠抗体可变区。本专利技术的单克隆抗体基于上述已克隆到的人Tim-3中和性单克隆抗体L3C轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、Fab抗体、抗体融合蛋白等；基于上述基因所编码的多肽或蛋白质，可以交联上多种生物活性分子，制备用于Tim-3表达水平检测、诊断和治疗Tim-3高表达所导致疾病的诊断或治疗药物。本专利技术基于L3C抗体构建了用于检测Tim-3的ELISA试剂盒，所述的ELISA试剂盒包括:rhGal-9蛋白、抗Tim_3抗体L3C、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品人Tim-3(100ug/ml，0.1ml)、阴性对照样品BSA。本专利技术还公开了检测Tim-3的ELISA试剂盒的使用方法:I)包被重组人rhGal-9蛋白(10ug/ml)到高亲和力ELISA板中，4°C过夜后用含0.2%吐温的PBS缓冲液洗涤5次；2)按合适的稀释度(1: 2~1: 10)稀本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗人Tim‑3中和性单克隆抗体或其片段，包括轻链CDR1‑3和重链CDR1‑3，其特征在于，所述轻链CDR1‑3的氨基酸序列为：CDR1：如序列表中SEQ ID NO：5所示；CDR2：如序列表中SEQ ID NO：6所示；CDR3：如序列表中SEQ ID NO：7所示；所述重链CDR1‑3的氨基酸序列为：CDR1：如序列表中SEQ ID NO：8所示；CDR2：如序列表中SEQ ID NO：9所示；CDR3：如序列表中SEQ ID NO：10所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩根成，陈国江，王仁喜，肖鹤，侯春梅，冯健男，黎燕，沈倍奋，蒋兴伟，杨小梅，李新颖，郎小玲，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11