用于检测水不混溶性化合物的微生物生成的方法和组合物技术

本文中提供了对于检测细胞中化合物的生成有用的方法和组合物，所述细胞例如经遗传修饰以与未经遗传修饰的亲本微生物细胞相比更高的产率和/或提高的持久性生成一或多种这类化合物的微生物细胞。在一些实施方案中，所述方法包括使溶液与直接结合重组生成的化合物的荧光染料接触，其中所述溶液包含多个重组生成所述化合物的细胞；并在适合于选择性检测结合至重组生成的化合物的荧光染料的光谱条件下检测荧光染料。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测水不混溶性化合物的微生物生成的方法和组合物对相关申请的交叉引用本申请要求2011年5月13日提交且题为“用于检测水不混溶性化合物的微生物 生成的方法和组合物”的美国临时专利申请N0.61/486，211的优先权，据此其通过提述完整 并入。
本文中提供的方法和组合物一般涉及微生物的工业用途。具体地，本文中提供了 对于检测细胞中工业上有用的化合物的生成有用的方法和组合物，所述细胞例如经遗传修 饰以与未经遗传修饰的亲本微生物细胞相比更高的产率和/或提高的持久性生成一或多 种这类化合物的微生物细胞。
技术介绍
微生物用于生产商业上有用的化合物导致了工业生物技术的出现。可以经由代谢 工程来衍生商业生产株，即定向修饰宿主细胞中的代谢通量。代谢工程的一项具体目标是 提高有价值化合物的胞内浓度或分泌同时使得其它通量对于存活力和生产力是最佳的。特 别期望能够实现高产率(每克底物的化合物克数)、高产量(每升克数)和/或高生产率(每小 时每升克数)的重组株。将株工程化改造成期望表型常常作为涉及几轮代谢通量工程化改 造、分析和建模的反复过程来进行。然而，代谢工程的所有方法分享共同的限制，即它们依 赖于针对改良性状的合适筛选方法。理想地，针对具有改进性能的株的筛选方法为:(I)足够灵敏以察觉从一种经修 饰群体到另一种经修饰群体在性能中的渐增改进；(2)足够特异性以区分内源分子与重组 生成的异源产物(不管是包含在细胞内还是分泌到周围培养基中)；(3)足够有力以一次性 筛选经修饰株的许多库；和(4)为生产对宿主的代谢影响提供信息。对于后者，可能的情况 是宿主中异源基因的输入和表达将导致代谢不平衡和/或毒性代谢物的积累。在这类场景 下，知晓生产是否以降低宿主的存活力为代价是有用的。此外，鉴于从一种生成群体到另一 种生成群体生物质广泛趋异的可能性，特异性检测重组产物而没有来自细胞生物质的影响 或输入的能力能为给定株的产率、产量和/或生产率提供更准确的描述。先前已经记载了高通量筛选方法，诸如机器人微量滴定板测定法或荧光相关细胞 分选。然而，随着代谢工程的新应用的发展，需要更加灵敏、产物特异性、且强力的测定法， 特别是关于期望化合物生成和宿主细胞存活之间的相容性提供一些指示的测定法。
技术实现思路
本文中提供对于检测细胞中重组生成的水不混溶性化合物(WIC)有用的方法和组 合物，所述细胞为例如经遗传修饰以与未经遗传修饰的亲本微生物细胞相比更高的产率和 /或提高的持久性生成一或多种水不混溶性化合物的微生物细胞。具体地，本文中提供的方 法提供用于筛选经工程化改造(例如为了生成工业上有用的水不混溶性化合物，包括但不限于类异戊二烯(isoprenoid)、聚酮化合物、脂肪酸及其衍生物)的微生物菌株的高通量、 灵敏且定量的手段。经由使用能够直接结合水不混溶性化合物的荧光染料，及能够对重组 细胞群体相对于它的生物质调查生成的化合物的量的选定光谱条件，所述方法容许特异性 检测异源胞内或分泌化合物。在第一个方面，本文中提供在溶液中检测自多个细胞重组生成的水不混溶性化合 物(WIC)的方法，所述方法包括:(a)使溶液与直接结合WIC的荧光染料接触，其中所述溶液包含多个重组生成所 述WIC的细胞；并(b)在适合于选择性检测结合至重组生成的WIC的荧光染料的光谱条件下检测荧 光染料。在一些实施方案中，所述WIC是自重组生成所述WIC的所述细胞分泌的。在一些 实施方案中，所述荧光染料是尼罗红。在一些实施方案中，所述荧光染料是B0DIPY493/503 或B0DIPY505/515。在一些实施方案中，所述包含多个细胞的溶液包含在多孔细胞培养板的孔中。在 一些实施方案中，在所述检测之前将所述细胞培养至少12小时的时段。在一些实施方案中，所述方法进一步包括测定WIC:细胞生物质比率的步骤。在一 些实施方案中，通过包括使用不检测来自结合至WIC的荧光染料的荧光的光谱条件检测所 述多个细胞的自身荧光的方法来测定所述细胞生物质。在一些实施方案中，所述荧光染料 是尼罗红，而且测定WIC:细胞生物质比率包括测定绿色对红色荧光的比率。在一些实施方案中，所述适合于特异性检测WIC的光谱条件通过包括下述步骤的 方法来确定:(a)使荧光染料与第一多个细胞群体和第二多个细胞群体接触，其中所述第一和 第二多个细胞群体的细胞与要筛选的WIC生成细胞属于相同细胞类型，其中每个多个细胞 群体包含具有细胞密度X的细胞群体和具有细胞密度5x的细胞群体，其中所述第一多个细 胞群体的每个细胞群体包含WIC，且所述第二多个细胞群体的细胞群体不包含WIC ；(b)分别测定所述第一多个细胞群体和所述第二多个细胞群体的激发光谱；并(C)选择激发波长，其中:(i)具有相同细胞密度的来自所述第一多个细胞群体的细胞群体和来自所述第二 多个细胞群体的细胞群体之间的荧光差异为至少80% ;且(i i)来自所述第二多个细胞群体、具有细胞密度X和细胞密度5x的细胞群体之间 的荧光差异不超过250%。在一些实施方案中，将步骤(b)的激发光谱的发射波长固定于550nm。在一些实施方案中，所述适合于特异性检测WIC的光谱条件通过包括下述步骤的 方法来确定:(a)使荧光染料与第一多个细胞群体和第二多个细胞群体接触，其中所述第一和 第二多个细胞群体的细胞与要筛选的WIC生成细胞属于相同细胞类型，其中每个多个细胞 群体包含具有细胞密度X的细胞群体和具有细胞密度5x的细胞群体，其中所述第一多个细 胞群体的每个细胞群体包含WIC，且所述第二多个细胞群体的细胞群体不包含WIC ；(b)分别测定所述第一多个细胞群体和所述第二多个细胞群体的发射光谱；并(c)选择发射波长，其中:(i)具有相同细胞密度的来自所述第一多个细胞群体的细胞群体和来自所述第二 多个细胞群体的细胞群体之间的荧光差异为至少80% ;且(ii)来自所述第二多个细胞群体、具有细胞密度X和细胞密度5x的细胞群体之间 的荧光差异不超过250%。在一些实施方案中，将步骤(b)的发射光谱的激发波长固定于290nm。在一些实施方案中，所述第一多个细胞群体的细胞群体包含至少2g/LWIC。在一些实施方案中，所述重组生成的水不混溶性化合物是类异戊二烯。在一些实 施方案中，所述重组生成的水不混溶性化合物是萜、C5类异戊二烯、C10类异戊二烯或C15类 异戍二烯。在一些实施方案中，所述重组生成的水不混溶性化合物是法呢烯(farnesene)。在另一个方面，本文中提供在溶液中检测自细胞生成并分泌的法呢烯的方法，所 述方法包括:(a)使溶液与尼罗红接触，其中所述溶液包含重组生成并分泌法呢烯的细胞；并(b)在激发波长约260至290nm和发射波长约530至570nm检测尼罗红。在一些实施方案中，所述细胞选自下组:酵母细胞，细菌细胞，哺乳动物细胞，真菌 细胞，昆虫细胞，和植物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是酵母细胞。在一些实施方案 中，所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在另一个方面，本文中提供液体组合物，其包含:(a)重组生成并分泌水不混溶性化合物的细胞；(b)自所述细胞分泌的水不混溶性化合物；(c)直接结合分泌的水不混溶性化合物的荧光染本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在溶液中检测自多个细胞重组生成的水不混溶性化合物（WIC）的方法，该方法包括：(a)使溶液与直接结合WIC的荧光染料接触，其中所述溶液包含多个重组生成WIC的细胞；并(b)在适合于选择性检测结合至重组生成的WIC的荧光染料的光谱条件下检测荧光染料。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.13 US 61/486,2111.一种在溶液中检测自多个细胞重组生成的水不混溶性化合物(WIC)的方法，该方法包括:(a)使溶液与直接结合WIC的荧光染料接触，其中所述溶液包含多个重组生成WIC的细胞；并(b)在适合于选择性检测结合至重组生成的WIC的荧光染料的光谱条件下检测荧光染料。2.权利要求1的方法，其中所述WIC是自重组生成所述WIC的所述细胞分泌的。3.权利要求1或2的方法，其中所述荧光染料是尼罗红。4.权利要求1或2的方法，其中所述荧光染料是B0DIPY493/503或B0DIPY505/515。5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述包含多个细胞的溶液包含在多孔细胞培养板的孔中。6.权利要求1-5任一项的方法，其中在所述检测之前将所述细胞培养至少12小时的时段。7.权利要求1-6任一项的方法，其进一步包括测定WIC:细胞生物质比率的步骤。8.权利要求7的方法，其中所述细胞生物质通过包括检测所述多个细胞的自身荧光的方法来测定。9.权利要求8的方法，其中检测所述多个细胞的自身荧光包括在不检测来自结合至 WIC的荧光染料的荧光的光谱条件下检测自身荧光。10.权利要求9的方`法，其中以激发波长330至350nm和发射波长470至510nm检测所述自身荧光。11.权利要求7的方法，其中所述荧光染料是尼罗红，且测定WIC:细胞生物质比率包括测定绿色对红色荧光的比率。12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述光谱条件包括在如下选择的激发波长检测荧光染料:(a)使荧光染料与第一多个细胞群体和第二多个细胞群体接触，其中所述第一和第二多个细胞群体的细胞与权利要求1的细胞属于相同细胞类型，其中每个多个细胞群体包含具有细胞密度X的细胞群体和具有细胞密度5x的细胞群体，其中所述第一多个细胞群体的每个细胞群体包含WIC，且所述第二多个细胞群体的细胞群体不包含WIC ；(b)分别测定所述第一多个细胞群体和所述第二多个细胞群体的激发光谱；并(c)选择激发波长，其中:(i)具有相同细胞密度的来自所述第一多个细胞群体的细胞群体和来自所述第二多个细胞群体的细胞群体之间的荧光差异为至少80% ;且(ii)来自所述第二多个细胞群体、具有细胞密度X和细胞密度5x的细胞群体之间的荧光差异不超过250%。13.权利要求12的方法，其中将步骤(b)的所述激发光谱的发射波长固定于550nm。14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述光谱条件包括在如下选择的发射波长检测荧光染料:(a)使荧光染料与第一多个细胞群体和第二多个细胞群体接触，其中所述第一和第二多个细胞群体的细胞与权利要求1的细胞属于相同细胞类型，其中每个多个细胞群体包含具有细胞密度X的细胞群体和具有细胞密度5x的细胞群体，其中所述第一多个细胞群体的每个细胞群体包含WIC，且所述第二多个细胞群体的细胞群体不包含WIC ；(b)分别测定所述第一多个细胞群体和所述第二多个细胞群体的发射光谱；并(C)选择发射波长，其中:(i)具有相同细胞密度的来自所述第一多个细胞群体的细胞群体和来自所述第二多个细胞群体的细胞群体之间的荧光差异为至少80% ;且(ii)来自所述第二多个细胞群体、具有细胞密度X和细胞密度5x的细胞群体之间的荧光差异不超过250%。15.权利要求14的方法，其中将步骤(b)的所述发射光谱的激发波长固定于290nm。16.权利要求12-14任一项的方法，其中所述第一多个细胞群体的细胞群体包含至少 2g/L WIC。17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述重组生成的水不混溶性化合物是类异戊二烯(isoprenoid)。18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述重组生成的水不混溶性化合物是萜、C5类异戊二烯、ClO类异戊二烯或C15类异戊二烯。19.权利要求1-18任一项的方法，其中所述重组生成的水不混溶性化合物是法呢烯 (farnesene)。20.权利要求1-19任一项的方法，其中所述细胞是包含编码甲羟戊酸(MEV)途径的一或多种酶的一或多段异源核苷酸序列的重组酵母细胞。21.权利要求20的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码法呢烯合酶的核酸。22.权利要求20的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码能将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶的异源核苷酸序列。`23.权利要求20的方法，其中所述重组酵母细胞包含编码能将甲羟戊酸转化成甲羟戊酸5-磷酸的酶的异源核苷酸序列。24.权利要求20的方法，其中所述一或多段异源核苷酸序列编码甲羟戊酸途径的超过一种酶。25.权利要求20的方法，其中所述细胞进一步包含编码能将异戊烯焦磷酸(IPP)转化成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的酶的异源核苷酸序列。26.权利要求25的方法，其中所述细胞进一步包含编码能修饰IPP或聚异戊二烯 (polyprenyl)以形成类异戍二烯化合物的酶的异源核苷酸序列。27.权利要求26的方法，其中所述酶选自下组:蒈烯(carene)合酶、牦牛儿醇 (geraniol)合酶、芳樟醇(Iinalool)合酶、朽1樣烯(Iimonene)合酶、香叶烯(myrcene)合酶、罗勒烯(ocimene)合酶、a -菔烯(pinene)合酶、^ -菔烯合酶、Y -職品烯(terpinene) 合酶、職品油烯(terpinolene)合酶、紫穗槐双烯(amorphadiene)合酶、a -法呢烯合酶、P -法呢烯合酶、法尼醇(farnesol)合酶、橙花叔醇(nerolidol)合酶、广藿香醇 (patchouliol)合酶、诺卡酮(nootkatone)合酶和松香双烯(abietadiene)合酶。28.权利要求26的方法，其中所述类异戊二烯是C5-C20类异戊二烯。29.权利要求28的方法，其中所述类异戊二烯选自下组:松香双烯、紫穗槐双烯、蒈烯、 a -法呢烯、P -法呢烯、法尼醇、牦牛儿醇、牦牛儿基牦牛儿醇(geranylgeranit...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·乌贝萨克斯，L·弗伦茨，
申请(专利权)人：阿迈瑞斯公司，
类型：
国别省市：