一种生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用，该菌为类球红细菌，拉丁文学名为Rhodobacter?sphaeroides；命名为NHU-ZDD菌株；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2012年4月13日；保藏编号：CGMCC?No.5998。本发明专利技术提供一种通过对EMP途径相关代谢途径的改造，提高辅酶Q10产量的方法，能将辅酶Q10的合成能力提高约30%，适合辅酶Q10的大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及生物
，公开了一种生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用，该菌为类球红细菌，拉丁文学名为Rhodobacter?sphaeroides；命名为NHU-ZDD菌株；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2012年4月13日；保藏编号：CGMCC?No.5998。本专利技术提供一种通过对EMP途径相关代谢途径的改造，提高辅酶Q10产量的方法，能将辅酶Q10的合成能力提高约30%，适合辅酶Q10的大规模工业化生产。【专利说明】一种生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种生产辅酶QlO工程菌的构建方法、工程菌及其应用。
技术介绍
辅酶Q是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，不同来源的辅酶Q其侧链异戊烯单位的数目不同，人类和哺乳动物是10个异戊烯单位，故称辅酶Q10。辅酶QlO是生物细胞呼吸链中的重要递氢体，是一种良好的生化药物，近年来已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗。此外，在治疗坏血病、十二指肠溃疡、坏死性牙周炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果。最近，研究者发现CoQlO具有抗衰老作用，从而将其应用扩展到化妆品和保健品领域，使其在国内外的需求进一步扩大。辅酶QlO的制备方法主要有三种，即动植物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。动植物组织提取法中动植物辅酶QlO含量低，而且各种化学成份复杂，并受原料和来源限制，因此产品成本高，价格昂贵，规模化生产受到了一定限制。化学合成法技术上比较成熟，主要是以来源较丰富的茄尼醇为原料合成的，但其产物为顺反异构体的混合物，生物活性低，合成生物活性高的CoQlO尚未达到工业化生产的程度。微生物发酵法合成的辅酶QlO成本低、无光学异构体，生物学活性高，大规模生产应用效果好。常用的微生物包括红螺菌，土壤杆菌，类球红细菌，根瘤菌等。其中类球红细菌培养简单，是辅酶QlO高效的生产菌之一。辅酶QlO分子结构由两部分组成:醌环部分和异戊二烯侧链部分。醌环骨架由分支酸途径合成，前体是对羟基苯甲酸。侧链由异戊二烯途径合成，侧链的长短决定了辅酶Q的种类的不同。在类球红细菌中，异戊二烯焦磷酸异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)与9分子异戊二烯焦磷酸(IPP)依次在栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶及聚十异戊二烯焦磷酸合酶的催化下生成聚十异戊二烯焦磷酸。十异戊二烯焦磷酸和对羟基苯甲酸缩合形成辅酶QlO的前体物，该前体物苯环经修饰之后形成目标产物辅酶Q10。在微生物中，合成IPP主要有两条途径，分别是真核生物的甲羟戊酸途径(MVP)和原核生物中的非甲羟戊酸途径(MEP)。在类球红细菌中，IPP由MEP途径合成。目前国内相关研究主要集中在多基因表达强化大肠杆菌上。尚无专利有关于通过基因过表达强化类球红细菌辅酶QlO的合成能力。
技术实现思路
本专利技术针对微生物发酵法生产辅酶QlO产量较低且生产成本较高等缺点，提供了一种能显著提高辅酶QlO产量的生产辅酶QlO工程菌及其构建与应用方法。通过引用该方法，可以极大提高应用微生物发酵法生产辅酶QlO的产量，降低了辅酶QlO的生产成本。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案:一种生产辅酶QlO的工程菌的构建方法，具体步骤如下:a.从类球红细菌中提取基因组DNA ;b.用聚合酶链式反应扩增出DXS和DDS的同源基因；c.用扩增出的同源基因与广宿主质粒连接，构建重组载体；d.重组载体转化至大肠杆菌S17-1中；e.将S17-1与所述类球红细菌接合转移，即得敲除了基因DXS和DDS的工程菌。作为优选，所述的DXS基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示，所述的DDS基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.2所示。作为优选，所述广宿主质粒为克隆载体pBBRlMCS-2，所述质粒的启动子为tac启动子。一株利用上述构建方法得到的用于生产辅酶QlO的工程菌，该菌为类球红细菌，拉丁文学名为Rhodobacter sphaeroides ;命名为NHU-ZDD菌株；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间:2012年4月13日；保藏编号=CGMCCN0.5998。应用上述工程菌生产辅酶QlO的方法，具体步骤如下:f.挑取NHU-ZDD菌株单克隆接种于含IOmL种子培养基的50mL摇瓶中，转速为200rpm，在26-34°C培养23h，获得一级种子；g.将一级种子按1%的比例转接至含20mL种子培养基的50mL摇瓶中，在26_34°C，200rpm的条件下培养23h，获得二级种子；h.将二级种子以1%的比例接种至含IOOmL发酵培养基的500mL中，在26_34°C，200rpm的条件下培养72h后，添加异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，诱导表达48h ；收集菌液；可通过常规方法提取辅酶Q10。作为优选，所述的种子培养基每IOOmL中含有:(NH4)2SO40.25g，玉米浆0.05g，酵母提取物 0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g，K2HPO40.05g, KH2PO4 0.05g, MgSO4 0.lg, FeSO40.01gjCoCl2 0.003g，MnSO40.0OOlg，CaCO30.8g，维生素 ΒΙΟ.1 μ g，维生素 K 0.1 μ g，维生素A0.15 μ g ;ρΗ 调节为 7.2。作为优选，所述的发酵培养基每IOOmL种含有:(NH4)2SO40.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖 4g，KH2PO4 0.15g，味精 0.3g，MgSO4 0.63g，玉米浆 0.4g，FeSO4 0.12g，CoCl2 0.005g，CaCO3 0.6g，维生素 B10.1 μ g,维生素 K 0.1 μ g,维生素 A 0.15 μ g ；ρΗ 调节为 7.2。作为优选，所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的浓度为0.0Ol-lOmM。所述类球红细菌从河边污泥中分离得到；大肠杆菌S17-1购自美国模式培养物集存库，编号ATCC47055。本专利技术由于采用了以上技术方案，具有以下显著的技术效果:本专利技术通过选择MEP途径中的关键酶DXS、DDS的过表达，完成对EMP途径相关代谢途径的改造。经过上述改造生产的工程菌，具有较高的辅酶QlO合成能力，相比现有用于生产辅酶QlO的类球红细菌或类似菌种，该工程菌具有更高的辅酶QlO生产能力。将该工程菌应用于辅酶QlO的微生物发酵法生产，能够在不改变原有的生产过程，工艺步骤，培养条件的情况下，使微生物发酵法生产辅酶QlO的生产能力在原有基础上提高达30%，具有较高的应用价值和工业实用性。保藏信息保藏名称:类球红细菌，拉丁文学名为Rhodobacter sphaeroides ;命名为NHU-ZDD菌株；保藏时间:2012年4月13日；保藏编号:CGMCCN0.5998 ；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细描述:实施例1生产辅酶QlO的工程菌的构建方法一、重组质粒的构建1.设计引物。用Primer5引物设计软件设计引物序列。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产辅酶Q10的工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：a.从类球红细菌中提取基因组DNA；b.用聚合酶链式反应扩增出DXS和DDS的同源基因；c.用扩增出的同源基因与广宿主质粒连接，构建重组载体；d.重组载体转化至大肠杆菌S17?1中；e.将大肠杆菌S17?1与类球红细菌接合转移，即得工程菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于洪巍，石一军，陆文强，王昌泽，张建新，
申请(专利权)人：浙江新和成股份有限公司，上虞新和成生物化工有限公司，
类型：发明
国别省市：