八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种八元瓜环自组装型分子信标，其特征在于，所述八元瓜环自组装型分子信标为发夹型分子，包括由核苷酸序列组成的茎-环结构、荧光团F和淬灭团Q、在带有荧光团F的一端有一个萘和/或其衍生物官能团、在带有淬灭团Q的一端有一个紫晶和/或其衍生物官能团、所述萘和/或其衍生物官能团及紫晶和/或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内。本发明专利技术的分子信标可最大限度消除背景荧光，提高检测灵敏度，特别地，即使发生核酸酶降解，其荧光团F和淬灭团Q仍将被八元瓜环“锁定”，不会产生假阳性信号，为分子信标性能优化提供了一种创新思路，对分子生物学和生物医学的发展具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种八元瓜环自组装型分子信标，其特征在于，所述八元瓜环自组装型分子信标为发夹型分子，包括由核苷酸序列组成的茎-环结构、荧光团F和淬灭团Q、在带有荧光团F的一端有一个萘和/或其衍生物官能团、在带有淬灭团Q的一端有一个紫晶和/或其衍生物官能团、所述萘和/或其衍生物官能团及紫晶和/或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内。本专利技术的分子信标可最大限度消除背景荧光，提高检测灵敏度，特别地，即使发生核酸酶降解，其荧光团F和淬灭团Q仍将被八元瓜环“锁定”，不会产生假阳性信号，为分子信标性能优化提供了一种创新思路，对分子生物学和生物医学的发展具有重要意义。【专利说明】八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种八元瓜环(CB)自组装型分子信标及其制备方法和应用。
技术介绍
1996年，Tyagi和Krammer设计了一种可以特异性识别核苷酸序列的新型突光探针-分子信标(Molecular Beacon, MB),它是由寡核苷酸形成的发夹型分子,分子的一端标记荧光染料，另一端标记淬灭团。该探针与核苷酸靶分子杂交后发生构象变化而发出荧光，没有识别靶序列的MB不发荧光，可以不必从检测体系中分离出来，大大简化了操作。茎环结构使MB对靶序列的识别有很强的特异性，甚至可以区分单碱基错配。由于其独特的性质和多功能性，MB在短时间内即得到了迅速发展，广泛应用于实时定量PCR监测、核苷酸动态定量测定、活细胞成像以及DNA/蛋白质相互作用研究等，临床医学上用于SARS病毒、乙肝病毒及癌症诊断等，并且其应用领域仍在不断拓展。随着MB应用研究的深入开展，特别是后基因组时代的到来，对细胞内mRNA的表达、折叠、运输和亚细胞定位的了解显得愈发重要，尤其是在单个活细胞内进行mRNA追踪，对于广大生物学家和化学家来说更是一个富有挑战性的课题。要想实现MB对活体mRNA的高灵敏检测，必须面对以下二个方面的挑战:第一是核苷酸酶对MB骨架的降解和破坏，其不可避免地产生假阳性信号(MB包括一段核苷酸片断，普通MB在细胞中稳定存在的时间大概为45分钟，随后细胞内核苷酸酶的酶切使荧光团与淬灭团分开，背景信号显著增强)；第二是灵敏度，尽管MB已经具有其他核苷酸探针无可比拟的灵敏度，但在不进行扩增的情况下，要实时监测单细胞内低丰度目 标物，其灵敏度仍远远不够。为解决上述问题，研究者开展了大量的工作。首先，为避免核苷酸酶降解，提高MB在细胞中的稳定性，尝试对MB的结构进行各种改造修饰。如采用2’-氧-甲基化碱基修饰MB、硫代修饰MB、肽核苷酸MB (PNA)等。但遗憾的是，2’ -氧-甲基化碱基修饰的MB与蛋白质可以进行非特异性结合，在细胞内背景信号很强；硫代化MB本身毒副作用比较大；肽核苷酸MB受限于其溶解度和团聚现象，使其应用受到了限制。提高灵敏度的研究则主要集中在增强荧光团的荧光强度和提高淬灭团的淬灭效率两个方面。在荧光团的改进方面，Tan研究组将具有高量子产率的水溶性聚电解质PPEs (Poly (phenylene ethynylene))通过聚合反应联结到DNA的末端作为分子信标的荧光团，虽然增强了分子信标与靶分子结合后的荧光信号强度，一定程度上提高了检测灵敏度，但其合成相对复杂(Huang H., et al.Design of a modular-basedfluorescent conjugated polymer for selective sensing.Angewandte ChemieInternational Edition, 2004，43:5635-5638)。Kim 等设计了一种用疏基乙酸包覆的量子点作为荧光团的分子信标，但其灵敏度还有待提高(Kim J.H., et al.Adaptation ofinorganic quantum dots for stable molecular beacons.Sensors and ActuatorsB:Chemical，2004，102:315-319)。在提高淬灭团的淬灭效率方面，Tan研究组将多个淬灭团同时修饰在分子信标上形成超淬灭分子信标，与带有单个淬灭团的分子信标相比，其灵敏度提高了将近14倍，但其合成难度及加工成本显著增加(Yang C.J.，et al.Molecularassembly of superquenchers in signaling molecular interactions.Journal of theAmerican Chemical Society，2005， 127:12772-12773)。
技术实现思路
目前对分子信标性能的改进都是围绕其茎-环结构，以及对荧光团、淬灭团进行修饰和调整，但现有方法都不能同时解决核苷酸酶切带来的假阳性和提高灵敏度两个难题。其根本原因是，现有分子信标中荧光团和淬灭团与核苷酸的连接都是借助柔性的长链，两者在空间上的相对自由势必导致彼此不能最大限度靠近，而荧光团与淬灭团在空间上的充分靠近是其发生能量转移导致荧光淬灭的必要前提。本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种能同时解决这两个难题的八元瓜环自组装型分子信标，并提供该分子信标的制备方法和应用。本专利技术的专利技术人经大量研究发现，解决假阳性信号的有效办法是保证核苷酸酶切后荧光信号团和淬灭团彼此不发 生分离，而提高荧光灵敏度的有效途径则是最大限度降低其背景荧光。依据文献，电子云密度较高的2，6- 二羟基萘(Np (OH)2)可以在带有正电荷的甲基紫晶(MV2+)陪伴下，通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内，三者自组装得到稳定性较高的1:1:1配位化合物-甲基紫晶/2，6-二羟基萘/八元瓜环(1 2+/恥(011)2/CB)。而染料与八元瓜环的自组装建立在热力学最稳定的构型基础之上。本专利技术的专利技术人在该现象的基础上通过深入研究，发现如果将萘及其衍生物引入到分子信标的荧光团末端，将紫晶及其衍生物引入到淬灭团末端，利用八元瓜环独特的自组装特性将分子信标的荧光团和淬灭团在底部“套箍”在一起，再加上分子信标茎部碱基对的“束缚”，就可彻底消除两者在空间上的相对自由度使彼此充分靠近，获得最高效率的荧光淬灭及高的信背比(signal-background ratio),大大提高检测灵敏度。此外，即使发夹的莖部被核苷酸酶降解切开，八元瓜环仍能将荧光团和淬灭团紧紧“锁定”，彼此不能分离，因此不会产生核苷酸酶切造成的假阳性信号，显著提高检测灵敏度。本专利技术的八元瓜环自组装型分子信标正是基于上述设计思想完成的专利技术，其特征在于，所述八元瓜环自组装型分子信标为发夹型分子，包括由核苷酸序列组成的茎-环结构、荧光团F和淬灭团Q、在带有荧光团F的一端有一个萘和/或其衍生物官能团、在带有淬灭团Q的一端有一个紫晶和/或其衍生物官能团、所述萘和/或其衍生物官能团及紫晶和/或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内，其结构式如通式I所示:【权利要求】1.一种八元瓜环自组装型分子信标，其特征在于，所述八元瓜环自组装型分子信标为发夹型分子，包括由核苷酸序列组成的茎-环结构、荧光团F和淬灭团Q、在带有荧光团F的一端有一个萘和/或其衍生物官能团本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种八元瓜环自组装型分子信标，其特征在于，所述八元瓜环自组装型分子信标为发夹型分子，包括由核苷酸序列组成的茎?环结构、荧光团F和淬灭团Q、在带有荧光团F的一端有一个萘和/或其衍生物官能团、在带有淬灭团Q的一端有一个紫晶和/或其衍生物官能团、所述萘和/或其衍生物官能团及紫晶和/或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内，其结构式如通式Ⅰ所示：通式Ⅰ中，表示由核苷酸序列组成的茎?环结构，其中环部分为与所要特异性识别的碱基序列成互补的单链碱基序列，茎部分为由5?8对互补的碱基序列组成的双链结构；表示八元瓜环；Ax、Ay各自独立地选自C1?10烷基、C1?10烷基氨基、C1?10烷氧基、C1?10酰胺基、C1?10卤代烷基和(CH2)xO(CH2)y，其中x、y为1～10的整数；F独立地选自荧光素类染料、罗丹明类染料、菁染料、二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芳香烃类及其衍生物官能团中的任意一种；Q独立地选自偶氮类染料及其衍生物官能团；R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1?6烷基、CHO、COOH、NH2、C1?6烷基氨基、OH、SH、C1?6烷氧基、C1?6酰胺基、取代或未取代的苄基、卤素和C1?6卤代烷基； m、n为1～10的整数。FDA0000372641870000011.jpg,FDA0000372641870000012.jpg,FDA0000372641870000013.jpg...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙世国，彭孝军，李志勇，王继涛，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：