本发明专利技术公开了一种同时检测中国人群苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因12个突变热点的试剂盒，所述试剂盒以中国人群PAH基因上的12个位点为检测对象，针对每个位点的突变类型分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个目的区段同时进行PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，一次获得12个突变热点的基因型。本发明专利技术针对中国人群苯丙酮尿症PAH基因突变的12个热点，提供一种简单、高通量、高效能、低成本、检测准确的适合中国人群的苯丙酮尿症PAH基因突变筛查用试剂盒，适用于中国人群苯丙酮尿症的群体性筛查。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种同时检测中国人群苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因12个突变热点的试剂盒，所述试剂盒以中国人群PAH基因上的12个位点为检测对象，针对每个位点的突变类型分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个目的区段同时进行PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，一次获得12个突变热点的基因型。本专利技术针对中国人群苯丙酮尿症PAH基因突变的12个热点，提供一种简单、高通量、高效能、低成本、检测准确的适合中国人群的苯丙酮尿症PAH基因突变筛查用试剂盒，适用于中国人群苯丙酮尿症的群体性筛查。【专利说明】中国人群苯丙酮尿症PAH基因筛查试剂盒
本专利技术涉及生物医学领域中基因突变检测领域，具体涉及一种筛查中国人群苯丙酮尿症PAH基因12个突变热点试剂盒。
技术介绍
苯丙酮尿症(Phenylketonuria,简称PKU)是一种常见先天性氨基酸代谢异常疾病，于1934年由挪威的Foiling医生发现，因患者尿液中含有大量的苯丙酮酸而得名。患儿出生时正常，若未经干预，随着进奶以后，一般在3-6个月时，出现症状，周岁时症状明显。其主要症状表现:兴奋不安、多动或嗜睡、萎靡、约25%的患儿出现惊厥，继之智能发育落后日渐明显；因黑色素合成不足，在生后数月毛发、皮肤和虹膜色泽变浅，约I / 3患儿伴有湿疹；尿和汗液呈特殊的鼠尿臭味。PKU的发病机理在于人体必需氨基酸苯丙氨酸在体内一部分被用于合成蛋白质，一部分通过酪氨酸代谢途径被降解。在酪氨酸代谢途径中，苯丙氨酸羟化酶(PAH)及其辅酶四氢生物蝶呤(BH4)催化苯丙氨酸降解成酪氨酸，当此二者中任何一种缺乏时，降解反应不能进行，导致苯丙氨酸的积累。血液中高浓度的苯丙氨酸在转氨酶的作用下生成苯丙酮酸、苯乳酸和苯乙酸等旁路代谢产物。这些产物部分随尿液和汗液排出，使尿液和汗液呈霉烂臭味；而大部分积聚在血液和脑脊液中，对婴幼儿神经系统造成不同程度的毒性作用，引起不可逆的大脑损伤和智力发育障碍。确诊后，上述症状经饮食控制后完全可以逆转，但神经损伤难以转变。因此，早诊断、早治疗对患儿、家庭和社会都有重大意义。PKU分为两种类型:经典型PKU和BH4缺乏型PKU ;其中经典型PKU占99%，是由于染色体基因突变导致肝脏中PAH缺陷从而引起苯丙氨酸代谢障碍所致。PKU是常染色体隐性遗传，其发病率在我国约为I / 11144，且北方高于南方。 人类PAH基因定位于染色体12q22_24.1全长约90Kb，成熟mRNA长约2.4Kb，共有13个外显子和12个内含子，编码由451个氨基酸组成的酶单体。迄今，在PAH基因上发现了大约500个致病突变，其中点突变在85%以上，在中国人群中已发现100多种PAH的致病突变类型，其中5%的突变尚未鉴明其致病性。PAH基因突变有的导致PAH相应氨基酸的改变，形成不稳定的PAH酶蛋白或降低酶的活性；有的甚至突变成终止密码子，导致PAH酶的缺失。PAH基因突变位点在不同人种和人群中的突变频率存在差异，我们对10篇国内不同地区PAH基因突变的分子流行病学调研文献及我们的检测结果进行综合分析发现本专利涵盖的12个位点的突变频率较高:168位点G — T突变为0.3%，331位点C — T突变为5.0%, IVS4—I位点G — A突变为3.8%，482位点T — C突变为1.4%，611位点A — G突变为5.0 %，721位点C — T突变为2.1 %，728位点G — A突变为21.7 %，782位点G — A突变为0.8%,977位点G — A突变为1.5%,1033位点G — A突变为0.2%, 1068位点C — A突变为5.6%和1238位点G — C突变为6.0 %。12种热点突变在我国的总突变率应该在53.4%左右。连锁分析表明，一个位点的纯合致病突变和两个或两个以上的复合杂合致病突变均可导致苯丙酮尿症，而一个杂合突变并不致病。因此，检测这12个热点突变可确诊28.5%的PKU患儿，并为49.8%的PKU患儿提供50%的遗传信息。目前，PKU是我国法定的两种新生儿筛查疾病之一。在婴儿出生经母乳喂养3天后，采集足跟血，采用时间分辨荧光法、酶法或串联质谱法，检测血液中苯丙氨酸的浓度进行初筛，这些方法都生化筛查手段，阳性病例仍需要进一步临床确诊或进行基因诊断。基因突变热点筛查，虽然无法替代上述常规技术，但是上述技术的良好的补充，尤其是在揭示是否携带致病基因型及潜在的遗传病因上具有明显优势。SNaPshot技术是通过多重PCR扩增目的区域后，经寡核苷酸引物延伸标记扩增，突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸。然后通过毛细管电泳进行片段分析，相当于单个位点的微测序，可以通过毛细管电泳图直观地判断突变位点的基因型。这一技术已经成功应用于人体叶酸利用能力基因多突变位点检测和耳聋基因多突变位点筛查，表明其是一种综合效益较好的较高通量检测多位点突变的方法。目前，对PAH基因进行基因检测手段繁多，如:PCR-SSCP、TGGE, DGGE, HRMA、“分子开关”技术、分子信标、DNA直接测序、二代测序等。然而，这些方法有的耗时多、有的成本高、有的效率低。中国专利CN101899518公开了一种试剂盒及其PCR扩增方法，检测苯丙酮尿症PAH基因7个突变热点。该专利在完成PCR反应和聚丙酰胺凝胶电泳后，通过直接观察产物条带的有无来判断苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的基因型。用聚丙酰胺凝胶电泳结果来判断基因型，分辨率较低，容易造成误判，并且该专利技术一次只能检测7个突变热点，未能囊括中国人苯丙酮尿症的主要突变基因，通量较低。由于PKU是我国法定的两种新生儿筛查疾病之一，筛查量非常大，因此在现今背景条件下，急需出现一种成本低、效率高、通量高、检测准确的检测手段。.
技术实现思路
本专利技术的目的是弥补目前现有突变筛查方法的不足，提供一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的苯丙酮尿症PAH基因突变筛查用试剂盒。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是:中国人群苯丙酮尿症PAH基因筛查试剂盒，该试剂盒包括以下内容:(I)反应试剂，包括 dNTP、5X 和 10XPCR 缓冲液、Mg2+离子、FastTaq 酶、SNaPshotMultiplex混合液、包括SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液的纯化试剂、包括单个位点纯合、杂合突变的阳性对照DNA样本、阴性对照DNA样本；(2)按一定比例混合的针对苯丙酮尿症PAH基因8个区段进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物；(3)按一定比例混合的针对苯丙酮尿症PAH基因12个突变热点的PCR延伸引物；所述试剂盒以PAH基因的168位点G —T突变(位于exon2)、331位点C — T突变(位于exon3)、IVS4—I位点G — A突变(扩增exon5) >482位点T — C突变(位于exon5)、611位点A — G突变(反向T — C突变,位于exon6) >721位点C — T突变(位于exon7)、728位点G — A突变(反向C — T突变，位于exon7)、782位点G — A突变(反向C — T突变，位于exon7) >977位点G — A突变(位于exon本文档来自技高网...
【技术保护点】
中国人群苯丙酮尿症PAH基因筛查试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含以下内容：(1)反应试剂，包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg2+离子、FastTaq酶、SNaPshot?Multiplex混合液、包括SAP酶、Exon?I酶及其配套的缓冲液的纯化试剂、包括单个位点纯合、杂合突变的阳性对照DNA样本、阴性对照DNA样本；(2)按一定比例混合的针对PAH基因突变热点所在的8个外显子进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物；(3)按一定比例混合的针对PAH基因12个突变热点的PCR延伸引物；所述试剂盒以PAH基因的168位点G→T突变、331位点C→T突变、IVS4—1位点G→A突变、482位点T→C突变、611位点A→G突变、721位点C→T突变、728位点G→A突变、782位点G→A突变、977位点G→A突变、1033位点G→A突变、1068位点C→A突变和1238位点G→C突变共12个PAH基因突变热点为检测对象，针对每个位点的突变类型分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个目的区段同时进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，在一个反应管中一次可以获得以上12个位点的基因分型；所述PAH基因168位点的扩增引物序列是5“?TTCATGCTTGCTTTGTCC?3’和5“?TTCAAATCTGCCTGTTCC?3’；所述PAH基因331位点的扩增引物序列是5’?GGGTATAACCAAGGGAAGG?3’和5’?CTCAACAAGCAAGGCAGA?3’；所述PAH基因IVS4—1位点的扩增引物序列与所述PAH基因482位点的扩增引物序列一致，为5’?GGGTATAACCAAGGGAAGG?3’和5’?CTCAACAAGCAAGGCAGA?3’；所述PAH基因611位点的扩增引物序列是5’?CCCCGACTCCCTCTGCTAA?3和5’?TGCCTCCACATACTTGTCTTCC?3’；所述PAH基因721位点的扩增引物序列与所述PAH基因728位点和782位点的扩增引物序列一致，为：5’?CGTCAAAGCCTATGTCCC?3’和5’?GCAATGAACCCAAACCTC?3；所述PAH基因977位点的扩增引物序列是5’?CCCTCCAGAAACACCCTCATAG?3’和5’?CCCACAGCCATCATCAAATC?3’；所述PAH基因1033位点的扩增引物序列与所述PAH基因977位点的扩增引物序列一致，为：5’?CCCTCCAGAAACACCCTCATAG?3’和5’?CCCACAGCCATCATCAAATC?3’；所述PAH基因1068位点的扩增引物序列是：5’?GGGCTGTGATGTAGAAGG?3’和5’?CACCTTTGTCACCACCTC?3’；所述PAH基因1238位点的扩增引物序列是5’?TAGGGAGGTGTCCGTGTT?3’和5’?TGTGGAAAGGTGGAATGA?3’。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑛，王本敬，毛君，李海波，李红，
申请(专利权)人：苏州市立医院，
类型：发明
国别省市：
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