一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学和分类学领域，本发明专利技术公开了一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法以及用于所述快速检测方法的引物对和试剂盒，所述常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法包括以下步骤：步骤一，提取待检测样品的基因组DNA作为模板；步骤二，以所述基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应获得PCR产物；步骤三，用限制性内切酶酶切所述PCR产物，获得酶切产物；步骤四，将所述PCR产物和所述酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳图进行物种鉴定。本发明专利技术方法操作简单，在保证鱼种存活基础上只需剪取少量鳍条或肌肉，快速准确的进行常见鲟鱼类鱼种的鉴别，增加了鉴定结果的准确性和可信度，极大提高了工作效率。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及分子生物学和分类学领域，本专利技术公开了一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法以及用于所述快速检测方法的引物对和试剂盒，所述常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法包括以下步骤：步骤一，提取待检测样品的基因组DNA作为模板；步骤二，以所述基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应获得PCR产物；步骤三，用限制性内切酶酶切所述PCR产物，获得酶切产物；步骤四，将所述PCR产物和所述酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳图进行物种鉴定。本专利技术方法操作简单，在保证鱼种存活基础上只需剪取少量鳍条或肌肉，快速准确的进行常见鲟鱼类鱼种的鉴别，增加了鉴定结果的准确性和可信度，极大提高了工作效率。【专利说明】—种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法
本专利技术涉及分子生物学和分类学领域，特别涉及一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法。
技术介绍
鲟鱼(sturgeon)隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、福鳍亚纲(Actinopterygii)、硬鳞总目(Ganoidomorpha)、鲟形目(Acipenseriformes),现在全世界共有2科6属27种。我国境内有2科3属8种，分别为施氏鲟(Acipenser schrenckii )、达氏鱼皇(Huso dauricus)、中华鲟(Acipenser sinensis)、达氏鱼皇(Acipenser dabryanus)、白鲟(Psephurus gladius)、西伯利亚鲟(Acipenser baerii)、小体鲟(Acipenser ruthenus)、裸腹鲟(Acipenser nudiventris),鲟鱼是一类古老的软骨硬鳞鱼,有“活化石”之称。这些古老的鲟鱼类均处于不同程度的濒危状态，甚至有的有灭绝的危险。鲟鱼卵营养丰富，以其卵加工制成的鲟鱼籽酱，价格昂贵，是国际公认的奢侈食材，被比作“黑色黄金”。目前国际上进行鲟鱼种类鉴定主要采用的方法包括形态学、生物化学和遗传学等方法。Congiu等使用AFLP分子标记方法进行了鲟鱼及鱼籽酱产品的鉴别应用,Chelomina等使用RAPD分子标记进行施氏鲟自然种群中杂交种鉴别分析。以线粒体为材料来研究鲟鱼类进化关系的研究报道相对也较多。主要集中在线粒体D-1oop序列部分、细胞色素B、12s rRNA、16s rRNA等基因。对线粒体DNA控制区的研究发现，多个种的鲟鱼线粒体DNA均存在异质现象。近年来国内外常用线粒体DNA控制区序列以及微卫星DNA标记开展鲟鱼的分子鉴定。这些技术手段尽管能够不同程度的对鲟鱼和鲟鱼产品进行相对精确的鉴定，但是，也存在技术操作繁琐、鉴定时间长、设备昂贵等缺点，且对操作人员技术要求较高。鉴于此，亟须开 发出能够快速、准确检测出常见鲟鱼的分子检测技术，用于市场监管、种质鉴定等用途。
技术实现思路
本专利技术目的之一在于提供一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法。本专利技术运用了较少的试剂以及方便快捷容易操作的实验过程，可以在较短时间内，在不处死鱼种的基础上，只需剪取少量鳍条或肌肉，快速准确的将小体鲟和达氏鳇从所述常见鲟鱼类中区分出来。一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测用试剂盒，其特征在于，包括:引物对；PCR 常规试剂:Taq DNA 聚合酶、10 X buffer PCR 缓冲液、MgCl2 和 dNTPs ；以及酶切试剂=IOXbuffer酶切缓冲液、100 X BSA、限制性内切酶Aval I和限制性内切酶Eagl-HF。优选的是，所述引物对为:上游引物，其为SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列；下游引物，其为SEQ ID N0.2所示的多核苷酸序列。一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，使用权利要求2所述试剂盒用于常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，包括以下步骤:步骤一，提取待检测样品的基因组DNA作为模板；步骤二，将所述基因组DNA使用所述试剂盒包含的试剂和所述引物对配制成PCR体系，配制成的PCR体系放入PCR扩增仪中将进行PCR扩增，反应完成之后，将PCR产物放入4°C保存备用；步骤三，用限制性内切酶酶切所述PCR产物，获得酶切产物；步骤四，将所述PCR产物和所述酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图进行物种鉴定。优选的是，所述PCR扩增反应的反应体系为15 μ 1:即为在200 μ I PCR反应管中加入 0.1 μ I 浓度为 2，500units/mL 的 Taq DNA 聚合酶，1.5 μ IlOXbufferPCR 缓冲液，1.5 μ 125mM MgCl2,1.2 μ I 浓度为 IOpm/ μ I 的 dNTPs, 2 μ I 所述基因组 DNA, 0.5 μ I 浓度为lOpm/μ I的所述上游引物，0.5μ I浓度为IOpm/μ I的所述下游引物和7.7 μ I无菌水。优选的是，所述PCR扩增反应的反应条件为94°C预变性5min，然后94°C变性30s、58°C退火30s、72°C延伸45s，从预热、退火到延伸共反应35个循环，然后72°C延伸lOmin。优选的是，反应体系一为在200μ I PCR反应管中加入Iyg所述PCR产物，2 μ IlOXbuffer酶切缓冲液，0.2 μ 1100XBSA和0.5 μ I限制性内切酶Avail，加无菌水至20 μ 1，然后将所述酶切反应体系在`37°C温育反应lh，65°C热失活20min ；反应体系二为在200 μ I PCR反应管中加入I μ g所述PCR产物，2μ IlOXbuffer酶切缓冲液，0.2 μ 1100 XBSA和0.5μ I限制性内切酶Eagl-HF，加无菌水至20 μ 1，然后将所述酶切反应体系在37°C温育反应15min，65°C热失活20min。优选的是，所述常见鲟鱼种类为中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧煌、闪光鲟和俄罗斯鲟。优选的是，区分小体鲟或达氏鳇与中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧煌、闪光鲟或俄罗斯鲟中任一种。优选的是，采用所述Avail限制性内切酶进行所述酶切反应后可将小体鲟和达氏鳇从所述常见鲟鱼类中区分出来，再采用所述Eagl-HF限制性内切酶进行所述酶切反应可将小体鲟与达氏鳇区分开。优选的是，所述限制性内切酶Aval I的酶切位点为中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧煌、闪光鲟或俄罗斯鲟所述PCR产物中多核苷酸序列5'的第196和197个碱基之间的磷酸二酯键，小体鲟和达氏鳇没有所述酶切位点；在区分小体鲟和达氏鳇的基础上，所述的限制性内切酶Eagl-HF酶切位点为中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧煌、闪光鲟、俄罗斯鲟和达氏鳇所述PCR产物中多核苷酸序列5'的第522和523个碱基之间的磷酸二酯键，小体鲟没有所述酶切位点；中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧煌、闪光鲟和俄罗斯鲟所述PCR产物中扩增多核苷酸序列分别为SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10 所示序列。本专利技术的有益效果是本专利技术方法根据小体鲟或达氏鳇与中华鲟、施氏本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种常见鲟鱼类的PCR?RFLP快速检测用试剂盒，其特征在于，包括：引物对；PCR常规试剂：Taq?DNA聚合酶、10×buffer?PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs；以及酶切试剂：10×buffer酶切缓冲液、100×BSA、限制性内切酶Avall和限制性内切酶Eag1?HF。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐鹏，刘晓勇，刘园园，孙效文，
申请(专利权)人：徐鹏，
类型：发明
国别省市：