一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基及方法技术

本发明专利技术属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及一种诱导分化培养基及方法。一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基，由A液、B液、C液组成，采用如下方法配制而成：A液：8～12ug?bFGF溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，过滤除菌，即得A液；B液：10～20ml香丹注射液加入到490～480ml人间充质干细胞无血清培养基中，即得B液；C液：4～8ugbFGF、4～8ugEGF、40～60ugBDNF、80～120ug?GM1溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，即得C液。本发明专利技术的将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的培养基，采用香丹注射液联合生长因子EGF、bFGF、BDNF、GM1诱导人脂肪间充质干细胞分化为神经细胞，所选用的诱导成分均无毒，诱导效率高，诱导时间短，诱导的细胞移植后无排斥，无伦理问题，安全性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于干细胞诱导分化
，具体涉及一种诱导分化培养基及方法。
技术介绍
神经系统损伤和神经退行性病变如帕金森氏病、阿尔茨海默病、亨廷顿氏病等，一直是困扰人类健康的难题，而细胞移植是治愈此类疾病的希望。目前用于移植治疗中枢神经系统损伤的主要是胚胎干细胞和神经干细胞，但由于供体来源难，伦理学异议、免疫排斥反应以及移植细胞存活困难等问题，发展空间有限。脂肪间充质干细胞来源广泛、取材容易，便于自体移植，具有强大的增殖能力，在体外长期培养过程中可以始终保持其多向分化潜能，在特定条件诱导下可以分化为成骨、软骨、肌腱、肌细胞、脂肪细胞、神经细胞和肝细胞等，是一种理想的组织工程种子细胞。干细胞的分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达，从而控制细胞表型和蛋白质的特异性分布。间充质干细胞分化为特定细胞类型主要取决于基因的激活，而细胞外微环境中各种因子类型和浓度则是基因激活的重要因素。间充质干细胞向神经细胞的诱导分化至少具有两方面的意义:一方面，揭示细胞的基因机制具有可塑性，外环境的变化能够激发出细胞的多能性，从而超越起源胚层的固有限制，分化为携带本胚层/其它胚层标志物的细胞。另一方面，作为产生移植用神经细胞的新途径，为临床移植治疗神经系统损伤提供机会。目前文献报道的运用间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞的研究报道非常多，主要有:(1)传统的化学诱导剂(抗氧化剂)法如:β-ΜΕ(β-巯基乙醇)、DMS0( 二甲基亚砜)、BHA (丁基羟基茴香醚)联合诱导等；(2)生长因子诱导法如:神经生长因子NGF，表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞 生长因子bFGF、维甲酸(RA)单独或者联合诱导等；(3)生长因子与化学诱导剂联合；(4)共培养或用接近生理状态的条件培养基；(5)基因转染；(6)中药丹参、黄芩苷等。表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor, bFGF)在胚脑和成年脑组织中均有分泌,是促细胞生长作用很强的多肽因子，又是重要的致有丝分裂原，主要通过细胞表面相应的受体促进神经干细胞向神经细胞增殖和分化。bFGF在体内作用广泛，在神经系统能维持神经元和神经胶质细胞的存活，诱导神经元合成神经特异性基因产物等，并能促进交感和副交感神经元的轴突生长，具有丝裂原样作用。EGF在神经系统可促进神经元轴突的延长和维持神经元的存活。EGF和bFGF作为中枢神经系统的重要生长因子，在神经系统形成过程中发挥重要作用，但两者对神经干细胞增殖、分化的作用不同。在胚胎干细胞向神经细胞分化的过程中，bFGF可促进神经外胚层向神经前体细胞转化；用定量PCR检测，bFGF能够促进未分化状态细胞的一些神经外胚层相关基因的表达。研究表明，不同浓度bFGF可使皮层神经前体细胞增殖或分化成神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞，而EGF则对发育较晚期的神经前体细胞有促进增殖和分化作。中药香丹注射液已被证明对心脑疾病确有临床疗效，且在临床广泛应用，具有抗氧化、抗缺血、改善微循环等功效。香丹注射液由丹参和降香组成，其浓度均为12g/100ml,其中主要含有丹参的水溶性成分丹参素。以蔡梅等对香丹注射液中丹参素的检测量为标准，推算出丹参素实际在注射液中的浓度约为Iyg/μ I ;实验时，直接将香丹注射液加入培养基，使其体积百分比浓度为2 4%,则丹参素的浓度为2 4μ g/μ I。因为丹参素为超氧负离子的清除剂，具有抗氧化作用，且已证实其具有诱导MSCs向神经细胞分化的功倉泛。脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor, BDNF)是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应，而且也是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需。GMl是最重要的神经节苷脂之一，在中枢神经系统病变的治疗中起重要作用。GMl除具有上述神经节苷脂的共同作用外，还可以通过维持中枢神经细胞膜上的Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，起到维持细胞内外离子平衡、减轻神经细胞水肿、防止细胞内Ca2+积聚的作用；GM1可以对抗兴奋性氨基酸的神经毒性作用，减少自由基对神经细胞的损害等。因此，GMl具有促进神经重构(神经重塑，神经可塑性)的作用，即通过促进各种形态、生化、组化、神经生理及行为参数的改善，最终可以加速神经修复，最大程度地恢复原有的神经功能。GMl能促进多种原因引起的中枢神经系统损伤后神经功能的恢复，促进神经重构。传统的化学诱导剂法虽然可以高效、快速地将脂肪间充质干细胞分化为神经细胞，但细胞死亡率较高(化学诱导剂具有一定毒性，BHA、DMS0等可使细胞突变，用于细胞移植存在致瘤性的危险)；生长因子诱导方法虽然诱导后细胞存活率高，但诱导时间长、诱导效率低。基因转染诱导因为基因改变存在罹患癌症的潜在风险。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有的诱导剂及诱导方法存在的缺陷，提供一种安全无毒、诱导效率高，诱导时间短的将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导分化完全培养基。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是:一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基，由A液、B液、C液组成，采用如下方法配制而成:A液:8 12ug bFGF溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，过滤除菌，即得A液，其中bFGF浓度16 24ng/ml ；B液:10ml 20ml香丹注射液加入到490 480ml人间充质干细胞无血清培养基中，混合后总体积为500ml，即得B液，其中香丹注射液体积终浓度为2% 4% ；C 液:4 8ugbFGF、4 8ugEGF、40 60ugBDNF、80 120ug GMl 溶于 500ml 人间充质干细胞无血清培养基中，即得C液，其中bFGF终浓度8 16ng/ml，EGF终浓度8 16ng/ml, BDNF 终浓度 80 120ng/ml，GMl 终浓度 160 240ng/ml。本专利技术的另一个目的是提供一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的方法，采用本专利技术提供的诱导培养基，具体包括以下步骤:1、制备脂肪间充质干细胞；2、脂肪间充质干细胞的鉴定:取P3代脂肪间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面标记；3、诱导脂肪间充质干细胞分化为神经细胞:先用A液预诱导24h，然后B液诱导6h，PBS洗涤，最后C液诱导分化5d ;4、诱导后神经细胞鉴定:形态学观察法；免疫细胞化学法检测诱导后NeuN、β -TubulinIII, GFAP的表达情况，NeuN、β -TubulinIII表达阳性者为神经细胞，GFAP表达阳性为神经胶质细胞；免疫荧光染色法检测诱导后细胞β-TubulinIII的表达情况，β -TubulinIII表达阳性为神经细胞。本专利技术的将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基，采用香丹注射液(有效成分丹参素)联合生长因子EGF、bFGF、BDNF、GMl诱导人脂肪间充质干细胞分化为神经细胞，所选用的诱导成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基，其特征在于：由A液、B液、C液组成，采用如下方法配制而成：A液：8～12ug?bFGF溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，过滤除菌，即得A液，其中bFGF浓度16～24ng/ml；B液：10ml～20ml香丹注射液加入到490～480ml人间充质干细胞无血清培养基中，混合后总体积为500ml，即得B液，其中香丹注射液体积终浓度为2％～4％；C液：4～8ug?bFGF、4～8ug?EGF、40～60ug?BDNF、80～120ug?GM1溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，即得C液，其中bFGF终浓度8～16ng/ml，EGF终浓度8～16ng/ml，BDNF终浓度80～120ng/ml，GM1终浓度160～240ng/ml。

【技术特征摘要】
1.一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基，其特征在于:由A液、B液、C液组成，采用如下方法配制而成: A液:8 12ug bFGF溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，过滤除菌，即得A液，其中bFGF浓度16 24ng/ml ； B液:10ml 20ml香丹注射液加入到490 480ml人间充质干细胞无血清培养基中，混合后总体积为500ml，即得B液，其中香丹注射液体积终浓度为2% 4% ； C 液:4 8ug bFGF、4 8ug EGF、40 60ug BDNF、80 120ug GMl 溶于 500ml 人间充质干细胞无血清培养基中，即得C液，其中bFGF终浓度8 16ng/ml，EGF终浓度8 16ng/ml, BDNF 终浓度 80 120ng/ml, G...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘海英，杨升宝，于丽，陈云燕，王清华，
申请(专利权)人：陈云燕，
类型：发明
国别省市：