一种体外培养间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及细胞工程领域，公开了一种体外培养间充质干细胞的方法。本发明专利技术所述方法采用1.073g/cm3Percoll分离液通过梯度密度离心法从骨髓、脐血或脐带中分离得到单个核细胞，将单个核细胞接种至含体积百分比为10%胎牛血清的α-MEM培养液中于37℃、5%CO2浓度条件下进行贴壁培养，至出现贴壁细胞并呈现出成纤维细胞状即获得间充质干细胞。本发明专利技术所述培养方法无需加入马血清、I-肌醇、L-谷氨酰胺、巯基乙醇等成分，成本低廉、配置简便，且细胞活力更高，细胞扩增所需的周期缩短，优于现有Dexter-LTC培养体系，能够为相应的治疗和研究提供高活力细胞来源。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞工程领域，具体提供了。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)最初在骨髓中发现，随着干细胞技术的不断发展，人们发现脐血、脐带中也富含间充质干细胞。间充质干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，具有分泌造血生长因子、低免疫原性、易于外源基因转染和表达等优点，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。目前，间充质干细胞采用Dexter-LTC培养体系(Dexter-type long-termcultures)培养:a -MEM+12.5% 胎牛血清 +12.5% 马血清 +0.2mmol/L 1-肌醇 +0.2mmol/L L-谷氨酰胺+10_4mol/L巯基乙醇，在此体系下培养出来的细胞符合间充质干细胞国际标准，这种方法也是本领域公认的、普遍的培养方法。但是，这种培养方法的细胞扩增周期较长，而且其培养基中除a-MEM基础培养基外还需要加入了马血清等较为昂贵的组分，成本高，组分多，操作复杂。此外，这种传统的方法细胞生长较为缓慢，扩增效率较低，所培养的细胞活力无法满足临床和科研的需要。因此，急需要建立一种低成本、操作简便、扩增效率高、细胞活力高的体外培养MSCs的方法，为相应的治疗和研究提供高活力细胞来源。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目 的在于提供，使得该制备方法制备的间充质干细胞成本更低、操作更简便、扩增效率高、细胞活力高。为实现以上专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案:采用1.073g/cm3Percoll分离液通过梯度密度离心法从骨髓、脐血或脐带中分离得到单个核细胞，将单个核细胞接种至含体积百分比为10%胎牛血清的a -MEM培养液中于37°C、5%C02浓度条件下进行贴壁培养，至出现贴壁细胞并呈现出成纤维细胞状即获得间充质干细胞。优选地，所述a -MEM培养基由以下组分组成:无水氯化钙200mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6800mg/L、磷酸二氢钠单水合物140mg/L、L-丙氨酸25mg/L、L-盐酸精氨酸126.98mg/L、L-天门冬酰胺50mg/L、L-天门冬氨酸30mg/L、L-盐酸半胱氨酸100mg/L、L-盐酸胱氨酸31.28mg/L、L-谷氨酸75mg/L、L-谷氨酰胺292mg/L、甘氨酸50mg/L、L_盐酸组氨酸41.88mg/L、L_异亮氨酸52.5mg/L、L-亮氨酸52.4mg/L、L_盐酸赖氨酸72.47mg/L、L-甲硫氨酸15mg/L、L_苯丙氨酸32mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-丝氨酸25mg/L、L-苏氨酸48mg/L、L-色氨酸IOmg/L、L-酪氨酸二钠盐51.9mg/L、L-纟颜氨酸46mg/L、L-抗坏血酸50mg/L、D-生物素0.1mg/L、D-泛酸I丐lmg/L、氯化胆碱lmg/L、叶酸lmg/L、肌醇2mg/L、烟酰胺lmg/L、盐酸卩比唆醒lmg/L、核黄素 0.lmg/L、盐酸硫胺 lmg/L、维生素 B121.36mg/L、腺苷酸 10mg/L、胞苷 10mg/L、D-葡萄糖1000mg/L、鸟苷mg/L、硫辛酸mg/L、苯酹红mg/L、丙酮酸钠mg/L、胸苷mg/L、脱氧腺苷10mg/L、脱氧胞苷盐酸llmg/L、脱氧鸟苷10mg/L、尿苷10mg/L、碳酸氢钠2200mg/L。本专利技术采用的骨髓、脐血或脐带由第三军医大学第二附属医院提供，采集前经被采集者同意并签署知情同意书，且已经通过了伦理委员会批准，所有标本的来源合乎我国相关法律规定。本专利技术所述梯度密度离心法为本领域分离单个核细胞的常规方法，为本领域技术人员熟知。现有培养间充质干细胞的Dexter-LTC培养体系需要加入马血清等成本昂贵的细胞因子且加入成分较多，操作复杂，同时细胞培养周期较长，扩增效率偏低，细胞活力不能满足带下临床和研究的需要，制约了间充质干细胞技术的应用发展。为此，经过本专利技术申请人深入研究，在原有Dexter-LTC培养体系基础上，剔除马血清等额外添加的组分，保留胎牛血清，优化培养条件，能够缩短细胞扩增周期，提高了其集落形成能力，在活力和扩增效率上明显优于现有培养方法培养的细胞。同时，作为优选，贴壁培养期间，第3d将培养瓶内一半体积的上清液更换为含体积百分比为10%胎牛血清的a -MEM培养液，第6d将培养瓶内全部的上清液更换为含体积百分比为10%胎牛血清的a-MEM培养液。此外，本专利技术还包括按1:2-1:4比例传代培养步骤。对贴壁细胞传代方法，属于本领域常规技术，在知晓原代培养方法的前提下，本领域技术人员能够进行传代培养，所述1:2-1:4比例是指贴壁细胞被消化下来后平均分成2 4份再重新接种培养扩增。经过本专利技术方法培养的细胞具有塑料底物粘附性，不表达或低表达⑶14、⑶34、⑶45，高表达⑶73、⑶90、⑶105，且在体外可被诱导成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，具有间充质干细胞典型的形态、表 面标志物和诱导分化特征，经鉴定符合国际细胞治疗学会提出的间充质干细胞的参考标准。分别采用本专利技术方法 和Dexter-LTC培养体系的方法进行生长曲线和集落形成能力的试验对比，结果显示，在Dexter-LTC培养体系下，间充质干细胞第10天进入对数生长期，第19天进入平台期；本专利技术所培养的间充质干细胞在第4天进入对数生长期，第15天进入平台期。细胞扩增周期明显变短。而在单个集落的克隆试验中，本专利技术所述方法的集落个数为11.3±1.53，单个集落中细胞数为66.5±14.4，而在Dexter-LTC培养体系下集落个数8.0±1.0，单个集落中细胞数为59.2±8.2，两者相比均具有显著差异，表明本专利技术培养间充质干细胞活力更强。由以上技术方案可知，本专利技术所述培养方法无需加入马血清、1-肌醇、L-谷氨酰胺、巯基乙醇等成分，成本低廉、配置简便，且细胞活力更高，细胞扩增所需的周期缩短，优于现有Dexter-LTC培养体系，能够为相应的治疗和研究提供高活力细胞来源。附图说明图1所示为间充质干细胞⑶14、⑶34、⑶45、⑶73、⑶90、⑶105免疫表型检测的流式细胞结果图；其中，图1-A为空白对照；图1-B为CD45免疫表型检测的流式细胞结果图；1_C为CD90免疫表型检测的流式细胞结果图；1_D为CD73、CD14免疫表型检测的流式细胞结果图；1-E为⑶34、⑶105免疫表型检测的流式细胞结果图；图2所示为间充质干细胞镜检图；其中，图2-A为原代细胞培养第3d 100倍镜检图；图2-B为第三代细胞培养第3d50倍镜检图；图2-C为第三代细胞培养第3d 100倍镜检图；图3所示为间充质干细胞诱导分化镜检图；其中，图3-A为成骨诱导分化茜素红染色镜检图，图3-B为成脂肪诱导分化油红染色镜检图，图3-C为成软骨诱导分化阿利辛蓝染色镜检图；图4所示为间充质干细胞集落克隆图；其中，图4-A为Dex ter-LTC体系单个集落克隆苏木素染色，图4_B为本专利技术单个集落克隆苏木素染色；图5所示为间质干细胞生长曲线折线图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外培养间充质干细胞的方法，其特征在于，采用1.073g/cm3Percoll分离液通过梯度密度离心法从骨髓、脐血或脐带中分离得到单个核细胞，将单个核细胞接种至含体积百分比为10%胎牛血清的α?MEM培养液中于37℃、5%CO2浓度条件下进行贴壁培养，至出现贴壁细胞并呈现出成纤维细胞状即获得间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种体外培养间充质干细胞的方法，其特征在于，采用1.073g/cm3Percoll分离液通过梯度密度离心法从骨髓、脐血或脐带中分离得到单个核细胞，将单个核细胞接种至含体积百分比为10%胎牛血清的a -MEM培养液中于37°C、5%C02浓度条件下进行贴壁培养，至出现贴壁细胞并呈现出成纤维细胞状即获得间充质干细胞。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述a-MEM培养液由以下组分组成: 无水氯化钙200mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6800mg/L、磷酸二氢钠单水合物140mg/L、L-丙氨酸25mg/L、L-盐酸精氨酸126.98mg/L、L-天门冬酰胺50mg/L、L-天门冬氨酸30mg/L、L-盐酸半胱氨酸100mg/L、L_盐酸胱氨酸31.28mg/L、L_谷氨酸75mg/L、L-谷氨酰胺292mg/L、甘氨酸50mg/L、L_盐酸组氨酸41.88mg/L、L_异亮氨酸52.5mg/L、L-亮氨酸52.4mg/L、L-盐酸赖氨酸72.47mg/L、L-甲硫氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸 32mg/L、L...

【专利技术属性】
技术研发人员：李忠俊，叶兴德，邓小军，冉茜，相丽欣，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：