抗病毒免疫的方法和组合物技术

提供了用作抗病毒疫苗的包含部分糖基化的病毒糖蛋白的免疫原性组合物。用单糖基化、二糖基化或三糖基化病毒表面糖蛋白和多肽配制的疫苗提供了有效且广泛的抗病毒保护，即使是跨越菌株。公开了包含单糖基化的血凝素多肽的药物组合物和由其产生的疫苗以及使用它们来预防或治疗病毒感染的方法。公开了用于流感病毒HA、NA和M2、RSV蛋白F、G和SH、登革病毒糖蛋白M或E、丙型肝炎病毒糖蛋白E1或E2以及HIV糖蛋白gp120和gp41的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗病毒免疫的方法和组合物相关申请的交叉引用本申请要求2009年3月27日提交的美国临时专利申请系列第61/164,385号，题目为“抗流感免疫的方法和组合物”、2009年3月28日提交的美国临时专利申请系列第61/164,387号，题目为“抗人类免疫缺陷病毒免疫的方法和组合物”、2009年3月28日提交的美国临时专利申请系列第61/164,388号，题目为“抗黄病毒属免疫的方法和组合物”、2009年3月28日提交的美国临时专利申请系列第61/164,389号，题目为“制备抗病毒感染疫苗的方法”、2010年3月12日提交的美国临时专利申请系列第61/313,676号，题目为“抗流感免疫的方法和组合物”的权益，所有申请的内容在此通过引用整体并入。参照序列表本申请包含序列表。序列表的计算机可读副本作为2010年3月24日产生的，名称为SEQ_LIST_OPK50101_ST25的ASCII文件由EFS-Web同时传送，该文件大小为42,952字节。序列表中所包含的信息在此通过引用整体并入。专利技术的
本专利技术通常涉及部分糖基化的病毒多肽，其用于产生可有效抗病毒的有效的、广泛反应性的免疫原性组合物。具体而言，本专利技术涉及利用单糖基化的流感病毒血凝素(HA)肽产生的疫苗，该疫苗表现出抗流感病毒的有效活性。本专利技术涉及包含糖蛋白的药物组合物和由其产生的疫苗，以及涉及利用去糖基化的HA多肽预防和治疗流感病毒感染的方法。专利技术背景在真核生物中，糖残基通常与四种不同的氨基酸残基连接。这些氨基酸残基被分成O-连接的(丝氨酸、苏氨酸和羟基赖氨酸)和N-连接的(天冬酰胺)。O-连接的糖在高尔基体或糙面内质网(ER)中由核苷酸糖合成。N-连接的糖由共同的前体合成，然后被加工。已知添加N-连接的碳水化合物链对于糖蛋白的折叠稳定、防止在内质网中降解、寡聚化、生物学活性和运输至关重要。将N-连接的寡糖添加到特定的Asn残基在调节病毒成熟蛋白的活性、稳定性或抗原性中起着重要作用(OpdenakkerG.etalFASEBJournal7，1330-13371993)。还认为N-连接的糖基化是糖蛋白的折叠、运输、细胞表面表达、分泌(Helenius，A.，MolecularBiologyoftheCell5，253-2651994)、保护免受蛋白水解降解和增加糖蛋白溶解性(Domsetal.，Virology193，545-5621993)所必需的。病毒的表面糖蛋白不仅是蛋白正确折叠所必需的，而且还作为“聚糖盾牌”提供针对中和抗体的保护。因此，强烈的宿主特异性选择通常与可能的N-连接糖基化的密码子位置相关。因此N-连接的糖基化位点在菌株和进化枝间趋向于保守。有三种主要类型的流感病毒：甲型、乙型和丙型。甲型流感病毒菌株能导致严重的疾病，并且是能导致人类流行性的唯一类型。H5N1菌株是甲型流感病毒。乙型菌株导致偶发的人类病症和小规模的爆发。丙型菌株仅很少导致人类感染，并且不会导致大规模的爆发。在甲型流感病毒中，只有H1、H2和H3亚型易于在人类之间传播。甲型流感病毒的爆发持续引起世界范围内的广泛的发病率和死亡率。仅美国，估计每年就有5％至20％的人口受到甲型流感病毒的感染，导致大约200,000人住院和36,000人死亡。广泛的疫苗接种策略的建立是限制流感发病率的有效措施。然而，病毒频繁的遗传漂移需要每年都要重新配制疫苗，这可能会导致疫苗中存在的病毒菌株和流通的病毒菌株之间发生错配。因此，针对流感病毒的抗病毒疗法是限制疾病严重性和传播的重要工具。自从2003年至今，高致病性H5N1流感病毒已在家禽和野生禽类中引起爆发(LiKSetal.(2004)Nature430：209-213)。自2010年2月起，这些病毒不仅感染了禽类而且还感染了超过478个人，其中286例被证实是致命的(www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2010_02_17/en/index.html)。高致病性H5N1和2009猪源性甲型流感(H1N1)病毒导致全球爆发，并引起对病毒中可能发生的其他改变会导致致命的流行性的强烈关注(GartenRJ，etal.(2009)Science325：197-201，NeumannG，etal.(2009)Nature459：931-939)。更关注流感病毒可能会获得在人之间有效传播的能力，进而成为流行性威胁。流感疫苗因而一定是任何流行性应对计划不可或缺的部分。流感病毒被划分为负链RNA病毒，且属于正粘病毒家族。甲型流感病毒由9种结构蛋白组成，并额外编码一种具有调节功能的非结构NS1蛋白。非结构NS1蛋白在生殖周期过程中大量合成，并定位在受感染细胞的胞液和细胞核中。在不同的病毒菌株混合感染细胞的过程中，病毒基因组的节段性特性允许发生遗传重组机制(基因组节段的交换)。根据展示在其表面上的不同的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)病毒蛋白，可进一步将甲型流感病毒分类成不同的亚型。甲型流感病毒亚型通过两种病毒表面糖蛋白来鉴定，即血凝素(HA或H)和神经氨酸酶(NA或N)。每种流感病毒亚型通过其H和N蛋白的组合来鉴定。有16种已知的HA亚型和9种已知的NA亚型。甲型流感病毒可以感染人、禽、猪、马和其他动物，但是野生禽类是这些病毒的天然宿主。目前只有一些甲型流感亚型(即H1N1、H1N2和H3N2)在人之间传播，但是16种H亚型和9种NA亚型的所有组合均在禽类中，尤其在野生水鸟和滨鸟中鉴定到。此外，越来越多的证据表明H5和H7流感病毒还可以引起人类疾病。甲型流感病毒的HA包含两段结构不同的区域，即球状头区和茎区。球状头区包含受体结合位点，其负责病毒附着于靶细胞和参与HA的血细胞凝集活性。茎区包含融合肽，其是病毒包膜和细胞内体膜之间的膜融合所必需的，并因此涉及融合活性(Wileyetal.，Ann.Rev.Biochem.，56：365-394(1987))。对了解流感感染的重要贡献来自对血凝素(HA)的研究，血凝素是与呼吸道中的特定唾液酸化的聚糖受体结合，从而允许病毒进入细胞的病毒衣壳糖蛋白(KuikenT，etal.(2006)Science312：394-397；MainesTR，etal.(2009)Science325：484-487；SkehelJJ，WileyDC(2000)AnnRevBiochem69：531-569；vanRielD，etal.(2006)Science312：399-399)。为了跨越物种障碍和感染人群，禽类HA必须改变其受体结合偏好性，从包含α2，3(禽类)-连接的唾液酸基序的末端唾液酸化的聚糖变成包含α2，6(人类)-连接的唾液酸基序(ConnorRJ，etal.(1994)Virology205：17-23)，并且如同在1918年的流行性中(TumpeyTM，etal.(2007)Science315：655-659)，该转变可能仅通过两次突变而发生。因此，了解影响流感病毒与聚糖受体结合的因素是开发控制具有流行性潜能的流感菌株在将来可发生任何转型的方法的关键。为了满足制备能诱导抗H5N1流感病毒不同菌株的有效中和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.03.27 US 61/164,385;2009.03.28 US 61/164,388;1.用于引发免疫应答的免疫原性组合物，所述组合物包含：选自流感病毒株H1、H3和H5的血凝素(HA)或其免疫活性片段的部分糖基化的流感病毒糖蛋白，其中所述糖蛋白包含至少一个糖基化位点，其中与在宿主细胞中表达时所述糖蛋白的糖基化位点处的糖基化状态相比，所述糖蛋白在一个或多个糖基化位点被部分糖基化，并且其中部分糖基化的位点为单糖基化的状态。2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的糖蛋白是通过使用化学或酶促方法中的一种或多种进行部分去糖基化而产生的。3.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的病毒抗原包含N-糖基化位点，所述N-糖基化位点包含天冬酰胺-Xaa-丝氨酸和天冬酰胺-Xaa-苏氨酸的氨基酸序列，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。4.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的流感病毒血凝素是用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和/或甘露糖糖基化的。5.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化的流感病毒血凝素是用N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)糖基化的单糖基化流感病毒血凝素。6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含含有Sa区的N-糖基化位点。7.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述部分糖基化位于HA多肽的第177位的天冬酰胺残基处，其中所述HA多肽的序列如SEQIDNO：10所示。8.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含含有共有H5HA序列的多肽，其中所述共有H5HA序列如SEQIDNO:4所示。9.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的共有H5HA序列在SEQIDNO:4的第39位、第170位、第181位、第302位和第495位中的一个或多个位置的天冬酰胺残基处糖基化。10.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含选自季节性NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗菌株)序列、共有H1-A和共有H1-C序列的H1多肽序列，其中所述季节性NIBRG-121序列如SEQIDNO:6所示，所述共有H1-A序列如SEQIDNO:8所示，所述共有H1-C序列如SEQIDNO:10所示。11.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素(HA)序列选自共有H5HA序列、NIBRG-121(流行性2009A(H1N1)疫苗)序列、共有H1-A和共有H1-C序列，其中所述共有H5HA序列如SEQIDNO：4所示，所述NIBRG-121序列如SEQIDNO：6所示，所述共有H1-A序列如SEQIDNO：8所示，所述共有H1-C序列如SEQIDNO：10所示，其中所述HA序列经替代蛋白上的跨膜区而修饰，从而能在合适的真核细胞中表达并从其分泌。12.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述单糖基化的流感病毒血凝素包含季节性H1多肽。13.疫苗，包含：(a)免疫原性多肽，其包含选自流感病毒株H1、H3和H5的血凝素(HA)或其免疫活性片段的部分糖基化的流感病毒糖蛋白，所述部分糖基化的流感病毒糖蛋白在一个或多个糖基化位点部分糖基化至单糖基化状态；(b)任选地，佐剂。14.如权利要求13所述的疫苗，其中所述流感病毒选自禽流感病毒或人类流感病毒。15.如权利要求14所述的疫苗，其中所述禽流感病毒是H5N1。16.如权利要求13所述的疫苗，其中一旦将单糖基化的流感HA多肽引入个体，所述多肽诱导所述个体产生与呼吸病毒结合的抗体，其中所述呼吸病毒是禽和/或人类流感病毒。17.如权利要求13所述的疫苗，其中一旦将单糖基化的流感HA多肽引入个体，所述多肽诱导所述个体产生与呼吸病毒结合的抗体，其中所述呼吸病毒是动物流感病毒。18.如权利要求13所述的疫苗，其中所述部分糖基化的免疫原性多肽是单糖基化的流感病毒HA多肽，所述单糖基化的流感病毒HA多肽包含具有天冬酰胺-Xaa...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁启惠，马彻，王正琪，陈俊叡，
申请(专利权)人：中央研究院，
类型：
国别省市：