PCV2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法技术

本发明专利技术涉及PCV2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法，提供了回收2型猪圆环病毒开放阅读框2表达的蛋白质的改进方法。该方法通常包括以下步骤：将含有开放阅读框2编码序列的重组病毒转染到培养基中生长的细胞中，使该病毒表达开放阅读框2，回收上清液中表达的蛋白质。应该在感染细胞约5天后开始回收，以表达足量的重组蛋白表达并从细胞分泌到生长培养基中。这种方法避免了分离和回收细胞内重组蛋白所需的昂贵和耗时的提取步骤。本发明专利技术还涉及含有所述蛋白或免疫原性组合物的容器、药盒。

【技术实现步骤摘要】
PCV2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法本专利技术专利申请是国际申请号为PCT/US2005/047596、国际申请日为2005年12月29日、进入中国国家阶段的申请号为200580047741.4、专利技术名称为“PCV2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请本申请要求2004年12月30日提交的临时申请序列号60/640,510的优先权和2005年1月13日提交的申请序列号11/034,737的优先权，将其内容纳入本文作参考。序列表本申请含有纸件形式和计算机可读形式的序列表，将其内容纳入本文作参考。
本专利技术一方面涉及回收2型猪圆环病毒(PCV2)的开放阅读框2(ORF2)表达的蛋白质。更具体说，所述蛋白是转染病毒表达的含有2型猪圆环病毒开放阅读框2的重组编码序列的重组蛋白。更具体说，使该转染病毒感染培养生长的细胞，并从上清液中、而非细胞内回收开放阅读框2表达的蛋白质。更具体说，该方法包括以下步骤：扩增2型猪圆环病毒开放阅读框2基因，将此扩增部分克隆入第一种载体，从此第一种载体上切下开放阅读框2部分并将其克隆入转运载体，将该转运载体与病毒载体共同转染入培养生长的细胞中，使该病毒载体感染细胞，表达开放阅读框2，回收上清液中表达的开放阅读框2编码的重组蛋白。另一方面，本专利技术涉及有效诱导对PCV2的免疫应答的免疫原性组合物和制备这些免疫原性组合物的方法。更具体说，本专利技术涉及有效保护接受该组合物的动物和减轻PCV2感染相关临床症状严重程度的免疫应答的免疫组合物。更具体说，本专利技术涉及对PCV2感染产生有效保护力的基于蛋白质的免疫组合物。更具体说，本专利技术涉及包含PCV2的ORF2的免疫组合物，其中给予PCV2-ORF2会产生抵抗PCV2感染的保护力。最具体说，本专利技术涉及能在接受该免疫组合物的猪中有效产生免疫力的免疫组合物，该组合物包含PCV2的ORF2表达的蛋白质。
技术介绍
2型猪圆环病毒(PCV2)是一种小的(直径17-22nm)二十面体无包膜DNA病毒，它含有单链环状基因组。PCV2与1型猪圆环病毒(PCV1)的序列相同性约为80%。然而，与通常无毒性的PCV1相反，感染PCV2的猪显示出一种常见综合征，称为断奶后多系统消瘦性综合征(PMWS)。PMWS的临床特征为消瘦、皮肤苍白、不健康、呼吸窘迫、腹泻、黄疸(icterus和jaundice)。在一些患病猪中，可出现所有症状的组合，而另一些猪仅有这些症状中的一种或两种。尸检过程中，许多组织和器官也出现了微观和宏观病损，淋巴器官是最常见的病损部位。观察到PCV2核酸或抗原含量与微观淋巴病损严重性之间强烈相关。感染PCV2的猪的死亡率可达到80%。除了PMWS以外，PCV2与几种其它感染相关，包括伪狂犬病、猪生殖和呼吸道综合征(PRRS)、Glasser病、链球菌性脑膜炎、沙门菌病、断奶后大肠杆菌病、饮食性肝机能障碍和化脓性支气管肺炎。PCV2的开放阅读框2(ORF2)蛋白在SDS-PAGE凝胶上跑电泳时分子量约为30kDa，过去曾将该蛋白用作PCV2疫苗的抗原性组分。获得用于这种疫苗的ORF2的一般方法通常由以下步骤组成：扩增编码ORF2的PCV2DNA，用ORF2DNA转染病毒载体，用含有ORF2DNA的病毒载体感染细胞，使该病毒在细胞中表达ORF2蛋白，裂解细胞提取细胞中的ORF2蛋白。在病毒载体感染细胞后，这些方法通常需要约4天。然而，这些方法的缺点是，提取步骤昂贵且耗时。此外，从细胞回收的ORF2的量不很高；因此，需要用大量病毒载体感染大量细胞，才能获得疫苗所需足量的重组表达蛋白质等。PCV2免疫的现有方法包括基于DNA的疫苗，如美国专利6,703,023所述。然而，这种疫苗不能有效产生抵抗PCV2感染和与其相关临床症状的保护性免疫力。因此，本领域需要一种获得ORF2蛋白的方法，该方法不需要从感染细胞内提取ORF2蛋白。还需要获得足够量的有效制备疫苗组合物的重组ORF2蛋白的方法。还需要不用现有ORF2蛋白提取方法所需的复杂的劳动密集型方法获得ORF2蛋白的方法。最后，关于组合物，本领域需要能产生抵抗PCV2感染的保护性免疫力并降低其严重性或防止其相关临床症状的免疫原性组合物。
技术实现思路
本专利技术克服了现有技术的固有问题，提供了优于现有技术水平的显著进步。具体说，本专利技术一方面提供了产生和/或回收重组PCV2ORF2蛋白的改进方法，即i)用含有PCV2ORF2DNA编码序列的重组病毒载体感染培养的易感细胞，在细胞0中由所述重组病毒载体表达ORF2蛋白，和ii)随后回收上清液中的ORF2。出人意料地发现，如果感染和随后培育感染细胞而不用原先从细胞内提取PCV2ORF2的经典PCV2ORF2回收过程，将会有大量ORF2释放入上清液中。而且，令人惊讶地发现，PCVORF2蛋白能强烈抵抗原先在生产细胞以外的降解。这两个发现使得能够从用含有PCV2ORF2DNA和表达PCV2ORF2蛋白的重组病毒载体感染的细胞培养物上清液中大量回收PCV2ORF2蛋白。大量产生PCV2ORF2蛋白指高于约20μg/mL上清，优选高于约25μg/mL，更优选高于约30μg/mL，更优选高于约40μg/mL，更优选高于约50μg/mL，更优选高于约60μg/mL，更优选高于约80μg/mL，更优选高于约100μg/mL，更优选高于约150μg/mL，最优选高于约190μg/mL。也可通过(例如)实施例1-3所述方法实现这些表达率。优选所述细胞培养物中的细胞计数约为0.3-2.0×106个细胞/mL，更优选约为0.35-1.9×106个细胞/mL，更优选约为0.4-1.8×106个细胞/mL，更优选约为0.45-1.7×106个细胞/mL，最优选约为0.5-1.5×106个细胞/mL。可由本领域技术人员确定优选细胞。优选细胞是易被含有PCV2ORF2DNA和表达PCV2ORF2蛋白的合适重组病毒载体感染的细胞。细胞优选为昆虫细胞，更优选包括以商标Sf+昆虫细胞出售的昆虫细胞(ProteinSciencesCorporation，Meriden，CT)。本领域技术人员也可确定合适的生长培养基，优选的生长培养基是无血清昆虫细胞培养基，如Excell420(JRHBiosciences，Inc.，Lenexa，KS)等。优选的病毒载体包括杆状病毒，如BaculoGold(BDBiosciencesPharmingen，SanDiego，CA)，具体说，如果生产细胞是昆虫细胞。虽然优选杆状病毒表达系统，但是本领域技术人员应理解，其它表达系统也可用于本专利技术目的，即须使PCV2ORF2表达到细胞培养物上清液中。其它表达系统可能需要采用信号序列，以使ORF2表达到培养基中。令人惊讶地发现，当用杆状病毒表达系统产生ORF2时，不需要任何信号序列或进一步修饰ORF2即能表达到培养基中。故认为，此种蛋白可独立地形成病毒样颗粒(JournalofGeneralVirology，第81卷，第2281-2287页(2000)和分泌入培养物上清液中。用含有PCV2ORF2DNA序列的重组病毒载体感染易感细胞时，感染复数(MOI)优选约为0.03-1.5，更优选约为0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疫苗，该疫苗含有至少2μg重组PCV2ORF2蛋白，其中，所述疫苗用于当以一个剂量给予猪时能有效减轻PCV2感染相关临床症状严重性的方法中，或含有至少2μg重组PCV2ORF2蛋白的一个剂量的疫苗，所述疫苗在用于以减轻猪中PCV2感染相关临床症状严重性的方法中有效。

【技术特征摘要】
2004.12.30 US 60/640,510;2005.01.13 US 11/034,7971.一种疫苗，该疫苗含有至少2μg重组PCV2ORF2蛋白，其中，所述疫苗用于当以一个剂量给予猪时能有效减轻PCV2感染相关临床症状严重性的方法中，或含有至少2μg重组PCV2ORF2蛋白的一个剂量的疫苗，所述疫苗在用于以减轻猪中PCV2感染相关临床症状严重性的方法中有效；其中，所述疫苗含有选自与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸的聚合物的佐剂，其中所述疫苗包含重组PCV2ORF2蛋白和一部分细胞培养上清液，所述疫苗通过包含以下步骤的方法获得：a)用含有PCV2ORF2DNA编码序列的重组杆状病毒载体感染培养的易感细胞；b)使所述ORF2蛋白由所述重组杆状病毒载体表达；c)收获含有所述ORF2蛋白的上清液；d)通过分离步骤分离细胞碎片；e)灭活所述重组杆状病毒载体；和f)添加佐剂。2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂是卡波姆。3.如权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂是卡巴浦尔。4.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂含有每剂500μg到5mg的卡巴浦尔。5.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂含有每剂750μg到2.5mg的卡巴浦尔。6.如权利要求1－5中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有4μg到200μg的重组PCV2ORF2蛋白。7.如权利要求1－5中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还含有稀释剂、等渗剂和/或稳定剂。8.如权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述稀释剂选自水、盐水、右旋糖、乙醇和甘油；所述等渗剂选自氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖；所述稳定剂选自白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐。9.如权利要求1－5中任一项所述的疫苗，其特征在于，每个剂量包含至少2μgPCV2ORF2蛋白和1μg/ml-60μg/ml的庆大霉素和/或硫柳汞。10.一种含有容器的药盒，所述容器含有至少一个剂量的当以一个剂量给予猪时能有效减轻PCV2感染相关临床症状严重性的免疫原性组合物，其中，一个剂量含有至少2μg重组PCV2ORF2蛋白，所述药盒还含有说明手册，所述说明手册包括将所述一个剂量的所述免疫原性组合物经肌肉内注射应用于小猪，以减轻PCV2感染相关临床症状严重性的信息；其中，所述免疫原性组合物含有选自与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸的聚合物的佐剂，其中所述免疫原性组合物包含重组PCV2ORF2蛋白和一部分细胞培养上清液，所述免疫原性组合物通过包含以下步骤的方法获得：a)用含有PCV2ORF2DNA编码序列的重组杆状病毒载体感染培养的易感细胞；b)使所述ORF2蛋白由所述重组杆状病毒载体表达；c)收获含有所述ORF2蛋白的上清液；d)通过分离步骤分离细胞碎片；e)灭活所述重组杆状病毒载体；和f)添加佐剂。11.如权利要求10所述的药盒，其特征在于，所述免疫原性组合物含有灭活的杆状病毒和细胞培养上清液。12.如权利要求10所述的药盒，其特征在于，所述病毒载体通过加入BEI而被灭活。13.如权利要求12所述的药盒，其特征在于，所述BEI用硫代硫酸钠中和。14.如权利要求10所述的药盒，其特征在于，所述佐剂是卡波姆。15.如权利要求14所述的药盒，其特征在于，所述佐剂是卡巴浦尔。16.如权利要求10所述的药盒，其特征在于，所述佐剂含有每剂500μg到5mg的卡巴浦尔。17.如权利要求16所述的药盒，其特征在于，所述佐剂含有每剂750μg到2.5mg的卡巴浦尔。18.如权利要求10所述的药盒，其特征在于，所述免疫原性组合物含有4μg到200μg的重组PCV2ORF2蛋白。19.如权利要求10所述的药盒，其特征在于，所述免疫原性组合物在24个月的时间内稳定。20.如权利要求10所述的药盒，其特征在于，所述免疫原性组合物有效预防PCV-2感染。21.如权利要求10所述的药盒，其特征在于，所述免疫原性组合物与含有猪生殖和呼吸道综合征(PRRS)抗原的免疫原性组合物一同给予。22.如权利要求21所述的药盒，其特征在于，所述PRRS抗原是包含在IngelvacPRRSMLV中的抗原。23.如权利要求21或22所述的药盒，其特征在于，当PRRS感染存在时，所述免疫原性组合物有效预防PCV2临床症状和疾病表现。24.如权利要求10所述的药盒，其特征在于，所述免疫原性组合物有效诱导针对PCV2的免疫应答。25.如权利要求10所述的药盒，其特征在于，所述免疫原性组合物是疫苗。26.如权利要求25所述的药盒，其特征在于，所述疫苗还含有稀释剂、等渗剂和/或稳定剂。27.如权利要求26所述的药盒，其特征在于，所述稀释剂选自水、盐水、右旋糖、乙醇和甘油；所述等渗剂选自氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖；所述稳定剂选自白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐。28.如权利要求10所述的药盒，其特征在于，每个剂量包含至少2μgPCV2ORF2蛋白和1μg/ml-60μg/ml的庆大霉素和/或硫柳汞。29.一种免疫原性组合物，该组合物含有至少2μg重组PCV2ORF2蛋白，所述组合物用于以一个剂量的组合物给予猪以引起针对PCV2的免疫应答；其中，所述免...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·艾希梅厄，G·尼策尔，M·谢弗，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰动物保健有限公司，
类型：发明
国别省市：