由全保护核苷磷酰胺中间体通过酸催化合成核苷三磷酸和核苷二磷酸的方法技术

一种由全保护核苷磷酰胺中间体通过酸催化合成核苷三磷酸和核苷二磷酸的方法，以苄氧羰基保护核苷为原料，与苄氧基二异丙基氨基亚磷酰氯在碱性条件下生成亚磷酰胺中间体粗品；再经弱酸催化水解得到核苷-氢亚磷酸二酯中间体粗品；核苷-氢亚磷酸二酯中间体粗品，与烷基胺进行氧化偶联，柱层析得到全保护核苷磷酰胺前体；再在N,N-二甲基甲酰胺溶液中经催化、氢化脱除全部保护基，之后过滤除去钯碳；与焦磷酸或单磷酸烷基铵盐在弱酸性催化剂存在的条件下反应得到核苷二磷酸和核苷三磷酸产物。本发明专利技术大幅度地提高了焦磷酸和单磷酸试剂与核苷磷酰胺中间体的反应速度和产率，为核苷5′-三磷酸和核苷5′-二磷酸的化学合成建立了一种高效和通用的新方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于天然产物类生化试剂的化学制备
，涉及一种。
技术介绍
核苷三磷酸是基因复制、转录、转译的物质基础，在分子生物学和医药研究中，脱氧核苷三磷酸有着广泛的应用。聚合酶连锁反应(Polymerase chain reaction, PCR)技术在体外利用DNA聚合酶扩增特定的DNA片断，被用于基因图谱的建立、亲子鉴定、基因克隆和疾病检测等。四种天然脱氧核苷三磷酸正是这项技术不可或缺的反应底物。目前，四种天然脱氧核苷三磷酸主要用于生产PCR实验试剂盒。而且随着PCR技术应用的拓展，其需求还在迅速递增。有关核苷三磷酸化学合成的研究最早可以追溯到上世纪中叶。目前，核苷三磷酸类化合物的化学合成已经建立了如“磷酰胺法”、“一锅三步法”、“水杨酸亚磷酰氯法”等多种可行的合成路线。虽然已知的各种方法有其各自适合的核苷底物类型，但是普遍合成产率不高，目前为止还没有任何一种方法可以适用于全部核苷三磷酸的高效合成，从而真正彻底解决核苷三磷酸化学合成的难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通用性强、高效的。本专利技术的 ，包括以下步骤: 全保护核苷磷酰胺中间体的合成方法: 1、以苄氧羰基(Cbz)保护核苷(如图1中物质1-9)为原料，与苄氧基二异丙基氨基亚磷酰氯(如图1中物质10)在碱性条件下生成亚磷酰胺中间体粗品，苄氧羰基保护核苷与苄氧基二异丙基氨基亚磷酰氯的摩尔比例为1:1-3 ;缚酸用的有机碱为三甲胺、三乙胺、三正丙胺、三异丙胺、三正丁胺、三异丁胺、三戊胺、三己胺、三辛胺、於甲基吗啉、甲基环己胺、1,4-二甲基哌嗪、二异丙基乙基胺，1，8-二氮杂二环 -|碳-7-烯中的任意一种；苄氧羰基保护核苷与有机碱的摩尔比例为1:1-5 ;反应溶剂为无水二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、乙醚、乙腈、四氢呋喃、1，4-二氧六环中的任意一种；反应温度在-50°C至+50°C之间，反应时间在30分钟至3小时。2、亚磷酰胺中间体粗品再经弱酸催化水解得到核苷-氢亚磷酸二酯中间体粗品，所使用的弱酸性催化剂为M1-四氮唑、4，5- 二氰基咪唑、I, 2，4-三氮唑、4-硝基苯酚、羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑、咪唑盐酸盐、甲基咪唑盐酸盐、吡啶盐酸盐、吡啶对甲苯磺酸盐、三乙胺盐酸盐中的任意一种；反应溶剂为乙腈、四氢呋喃、1，4-二氧六环中的任意一种；反应温度在_50°C至+50°C之间，反应时间在10分钟至2小时。3、核苷-氢亚磷酸二酯中间体粗品，最后与烷基胺进行氧化偶联，柱层析得到全保护核苷磷酰胺前体，所使用的烷基胺为哌啶、4-甲基哌啶、吗啉、脯氨酸甲酯中的任意一种，与上一步中间体的摩尔比例为1:3-10 ;氧化剂为四氯化碳、六氯乙烷、四溴化碳、溴代琥珀酰亚胺、碘中的任意一种，与上一步中间体的摩尔比例为1:5-30;有机碱为三甲胺、三乙胺、三正丙胺、三异丙胺、三正丁胺、三异丁胺、三戊胺、三己胺、三辛胺、甲基吗啉、於甲基环己胺、1，4-二甲基哌嗪、二异丙基乙基胺、1，8-二氮杂二环 i^一碳-7-烯、吡啶、2，6-二甲基吡啶中的任意一种，与上一步中间体的摩尔比例为1:2-20 ;反应溶剂为二氯甲烷、1，2- 二氯乙烷、氯仿、乙醚、乙腈、四氢呋喃、1，4- 二氧六环中的任意一种；反应温度在_50°C至+80°C，反应时间在15分钟至3小时。核苷二磷酸和核苷三磷酸的酸催化合成方法: 1、全保护核苷磷酰胺(如图1中物质11-46)在#，#-二甲基甲酰胺溶液中经催化、氢化脱除全部保护基，之后过滤除去钯碳，其工艺条件是，5%或10%钯碳与全保护核苷磷酰胺的质量比例为1:10-20，缚酸用的有机碱为三甲胺、三乙胺、三正丙胺、三异丙胺、三正丁胺、三异丁胺、三戊胺、三己胺、三辛胺、於甲基吗啉、於甲基环己胺、1，4-二甲基哌嗪、二异丙基乙基胺、1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯中的任意一种，全保护核苷磷酰胺与有机碱的摩尔比例为1:1_2，氢气压力在1-2个大气压，反应溶剂为#，#_ 二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，反应温度为0°C至+40°C，反应时间在6至72小时。2、上述核苷磷酰胺前体再与焦磷酸或单磷酸烷基铵盐在弱酸性催化剂存在的条件下反应得到核苷二磷酸和核苷三磷酸产物，所述焦磷酸盐为焦磷酸三(四正丁铵)盐、三(三乙铵)盐、三(三正辛铵)盐、二(四正丁铵)盐、二 (三乙铵)盐、二(四正辛铵)盐中的任意一种，其与磷酰胺的质量比例为2-3:1 ;单磷酸盐为单磷酸二(四正丁铵)盐、二 (三乙铵)盐、二 (三正辛铵)盐、单(四 正丁铵)盐、单(三乙铵)盐、单(四正辛铵)盐中的任意一种，其与磷酰胺的质量比例为2-5:1 ;弱酸性催化剂为4，5- 二氰基咪唑，IH-四氮唑、吡啶盐酸盐、批啶对甲苯磺酸盐、二甲基苯胺盐酸盐中的任意一种，与磷酰胺的质量比例为4-10:1 ；反应温度在0°C至+30°C，反应时间在6至72小时。3、上述步骤的粗产物经过乙醇沉淀,离子交换凝胶色谱(Sephadex A-25)或反相C18 HPLC纯化，以及最终的离子交换得到18种高纯度核苷二磷酸和核苷三磷酸(如图1中物质 47-64)。本专利技术的，通过全保护核苷磷酰胺中间体，利用弱酸性催化剂活化五价磷-氮键的方法，大幅度地提高了焦磷酸和单磷酸试剂与核苷磷酰胺中间体的反应速度和产率，为核苷5'-三磷酸和核苷5' - 二磷酸的化学合成建立了一种高效和通用的新方法。附图说明图1为本专利技术方法的反应步骤示图。图2为本专利技术方法的反应步骤示图。具体实施方式实施例1: N- (O-苄基-O-{2' ,V - 二苄氧羰基)尿苷-5'-)磷酰哌啶(如图1中物质11)的合成:将2'，3' -二苄氧羰基尿苷(如图1中物质1，500 mg,0.98 mmol)溶于干燥乙腈(20 ml),在搅拌的条件下加入干燥二异丙基乙基胺(0.43 ml, 2.5 mmol)。将节氧基氯代亚磷酰二异丙胺(如图1中物质10，534 mg, 1.95 mmol)溶于无水干燥乙腈(10 ml)中，然后缓慢滴加到反应瓶中。滴加完毕，继续反应45分钟。减压浓缩反应液，残余物再用乙腈(10ml)共沸两次。向残余物中加入少量乙酸乙酯，沉淀生成的二异丙基乙基胺盐酸盐。过滤除盐，将滤液浓缩后，得黄色油状化苄基-^-(2'，3' - 二苄氧羰基)腺苷-5'-亚磷酰二异丙胺中间体粗品。将油状物溶于乙腈(20 ml)中，加入1"-四氮唑(140 mg, 2 mmol)和水(0.2 ml)，室温搅拌10分钟。浓缩反应液，将残余物溶于乙酸乙酯(50 ml)中，然后依次用2%稀盐酸(30 ml)和水(30 ml)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩得油状核苷苄基氢亚磷酸二酯粗品。将哌啶(146 1,1.47 mmol)溶乙腈(10 ml)中，然后加入甲基吗啉(0.05 ml)和四氯化碳(0.15 ml)。将尿苷苄基氢亚磷酸二酯粗品溶于乙腈(2 ml)，在冰浴的条件下，缓慢滴入哌啶溶液中。滴加完毕后，继续反应20分钟。减压浓缩，残余物中加入少量乙酸乙酯，沉淀生成的的於甲基吗啉盐酸盐，过滤除盐。将滤液浓缩后得到黄色油状物。硅胶柱层析分离(石油醚:乙酸乙酯=1:2至二氯甲烷:甲醇=50:1)，得到白色泡沫状固体615 mg，产率:84%。实施例2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由全保护核苷磷酰胺中间体通过酸催化合成核苷三磷酸和核苷二磷酸的方法，其特征在于：它包括以下步骤：?全保护核苷磷酰胺中间体的合成方法：（a）、以苄氧羰基保护核苷为原料，与苄氧基二异丙基氨基亚磷酰氯在碱性条件下生成亚磷酰胺中间体粗品；（b）、亚磷酰胺中间体粗品再经弱酸催化水解得到核苷?氢亚磷酸二酯中间体粗品；（c）、核苷?氢亚磷酸二酯中间体粗品，最后与烷基胺进行氧化偶联，柱层析得到全保护核苷磷酰胺前体；核苷二磷酸和核苷三磷酸的酸催化合成方法：（d）、全保护核苷磷酰胺在N,N?二甲基甲酰胺溶液中经催化、氢化脱除全部保护基，之后过滤除去钯碳；（e）、再与焦磷酸或单磷酸烷基铵盐在弱酸性催化剂存在的条件下反应得到核苷二磷酸和核苷三磷酸产物；（f）、上述步骤的粗产物经过乙醇沉淀，离子交换凝胶色谱或反相C18?HPLC纯化，以及最终的离子交换得到18种高纯度核苷二磷酸和核苷三磷酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙麒，龚珊珊，孙剑，蒲守智，刘国栋，多树旺，肖强，
申请(专利权)人：江西科技师范大学，
类型：发明
国别省市：