一种检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括：核酸释放剂，PCR反应液，酶混合液，鲍曼不动杆菌阳性对照，鲍曼不动杆菌阴性对照；其中，所述PCR反应液包括：PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸扩增的引物，用于靶多核苷酸扩增的探针，用于内标片段扩增的引物和用于检测内标的探针。本发明专利技术实施例经条件优化，筛选出了扩增效果最好的用于靶多核苷酸扩增的引物和用于靶多核苷酸扩增的探针，所述试剂盒可检测出鲍曼不动杆菌各型感染，但不能检测出非鲍曼不动杆菌病原体，具有较高的特异性，因此大大提高了检测灵敏度，准确度和稳定性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒及检测方法。
技术介绍
目前鲍曼不动杆菌的实验室诊断方法主要运用商业化的细菌鉴定系统，如API20NE、VITED2、Phoenix和MicroScanWalkAway，然而其错误率高达25％。基于生化和细菌培养的鉴定方法，细菌培养的鉴定方法不仅灵敏度低，其培养周期长达24-72小时，经常使患者错过了最佳的治疗时期。临床上检测鲍曼不动杆菌-DNA主要是利用实时荧光PCR技术。此技术的改进和应用在近几年发展迅猛。此技术将PCR、分子杂交和光化学有机的融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行。使用荧光定量PCR仪一种带有某些特定波段发射光源和荧光检测装置的PCR扩增仪，收集检测荧光信号，通过相应分析软件，将检测到的荧光信号与循环数对应，试验结束后可自动分析获得扩增曲线；根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。国内已有数种基于实时荧光PCR技术检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的鲍曼不动杆菌-DNA提取方法主要是煮沸法。在实际临床应用中，此方法暴露出诸多不足之处，核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，DNA损耗严重，且对高浓度的样本存在裂解和富集不充分，检测结果的准确度低。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提供一种检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒及检测方法，以解决现有的基于实时荧光PCR技术检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒，检测过程，检测准确度低的问题。第一方面本专利技术实施例提供了一种检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒，所述试剂盒包括：核酸释放剂，PCR反应液，酶混合液，鲍曼不动杆菌阳性对照，鲍曼不动杆菌阴性对照；其中，所述PCR反应液包括：PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸扩增的引物，用于靶多核苷酸检测的探针，用于内标片段扩增的引物和用于检测内标的探针；所述用于靶多核苷酸扩增的引物包括：鲍曼不动杆菌-F和鲍曼不动杆菌-R；所述鲍曼不动杆菌-F的碱基序列为：5’-GCTTCCGCTATTCCARTTTATCA-3’；所述鲍曼不动杆菌-R的碱基序列为；5’-AACCAACACGCTTCACTTCMTTA-3’；所述用于靶多核苷酸检测的探针的碱基序列为：5’-TTAGCTCGTCGTATTGGACTTGARCTCATGT-3’。进一步，所述用于内标片段扩增的引物包括：上游引物IC-F和下游引物IC-R；所述上游引物IC-F的碱基序列为：5’-CCGACGAGCCGAACCACA-3’所述下游引物IC-R的碱基序列为：5’-CACACCACGGACACACAAAGGA-3’；所述用于检测内标的探针的碱基序列为：5'-CAAGACGGATTGCGAGCCTTACAGC-3'。进一步，所述内标为插入pMD18T载体的一段长为177碱基对的人工合成DNA序列的重组体；所述内标的177碱基对序列为：5-ATGCCATGAAAGCTTCCGCTATTCCATTTATCAAGATTTAGCTCGTCGTATTGGACTTGACTCATGTCTAAGGAAGTGAAGCGTGTTGGTTATGGCAATGCAGATATCGGTACCCAAGTCGATAATTTTTGGCTGTGGGTCCTTAAAAATTACTCCTCAGCAAGAGGCACATTTGCT-3’。进一步，所述酶混合液由0.2U/μl～5U/μl耐热DNA聚合酶和0.02U/μl～0.2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶组成。进一步，所述核酸释放剂包括：浓度为0.01～0.1mM/L的莎梵婷、浓度为200～500mM/L的氯化钾、浓度为0.01％～2％g/mL十二烷基磺酸钠和体积/体积为0.02％～5％的乙醇。进一步，所述PCR缓冲液由浓度为200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、浓度为20mmol/L氯化镁溶液、浓度为500mmol/L氯化钾溶液、体积/体积为0.2％曲拉通溶液和体积/体积为10％甲酰胺溶液组成。进一步，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的pH为7.5。进一步，所述鲍曼不动杆菌阳性对照为临床医院收集的鲍曼不动杆菌强阳性样本；所述鲍曼不动杆菌阴性对照为不含有鲍曼不动杆菌的灭活阴性临床样本。本专利技术实施例第二方面示出一种检测鲍曼不动杆菌DNA的检测方法，所述方法包括：S101：向每个PCR反应管中均加入核酸释放剂2～5μl，并依次加入待测样本，阴性对照，阳性对照，得到待测PCR反应管；S102；向每个所述待测PCR反应管中均加入PCR反应液38～43μl，3000rpm离心30秒，放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。本专利技术第三方面示出一种检测鲍曼不动杆菌DNA的检测方法，所述方法包括：S201：取100～500μl待测样本，13,000rpm离心5分钟除去清液，加入30～50μl释放剂，静置10分钟后，得到预处理的待测样本；S202：每个PCR反应管中加入5～10μl所述预处理的待测样本、阴性对照、阳性对照，得到待测PCR反应管；S203：每个所述待测PCR反应管中均加入PCR反应液38～43μl，3000rpm离心30秒，放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。由以上技术方案可知，本专利技术实施例示出一种检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括：核酸释放剂，PCR反应液，酶混合液，鲍曼不动杆菌阳性对照，鲍曼不动杆菌阴性对照；其中，所述PCR反应液包括：PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸扩增的引物，用于靶多核苷酸扩增的引物，用于内标片段扩增的引物和用于检测内标的探针。本专利技术应用DNAStar软件包中的SeqMan和MegAlign软件对Genbank中检索到的鲍曼不动杆菌基因组序列进行同源性比较，找出同源保守区段，在鲍曼不动杆菌的最保守区域设计了5对引物和探针，经优化，筛选出了扩增效果最好的用于靶多核苷酸扩增的引物和用于靶多核苷酸扩增的探针，所述试剂盒可检测出鲍曼不动杆菌各型感染，但不能检测出非鲍曼不动杆菌病原体，具有较高的特异性，因此大大提高了检测灵敏度，准确度和稳定性；同时本专利技术实施例示出的一种检测鲍曼不动杆菌DNA的检测方法采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外膜，释放出病原体核酸，无需加热，无需离心，只需一个移液器，即可完成DNA的释放和提取；所述方法具体有检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：核酸释放剂，PCR反应液，酶混合液，鲍曼不动杆菌阳性对照，鲍曼不动杆菌阴性对照；其中，所述PCR反应液包括：PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸扩增的引物，用于靶多核苷酸检测的探针，用于内标片段扩增的引物和用于检测内标的探针；所述用于靶多核苷酸扩增的引物包括：鲍曼不动杆菌‑F和鲍曼不动杆菌‑R；所述鲍曼不动杆菌上游引物Ab‑F的碱基序列为：5’‑GCTTCCGCTATTCCARTTTATCA‑3’；所述鲍曼不动杆菌下游引物Ab‑R的碱基序列为；5’‑AACCAACACGCTTCACTTCMTTA‑3’；所述用于靶多核苷酸检测的探针Ab‑P的碱基序列为：5’‑TTAGCTCGTCGTATTGGACTTGARCTCATGT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：核酸释放剂，PCR反应液，酶混合液，鲍曼不动杆菌阳性对照，鲍曼不动杆菌阴性对照；其中，所述PCR反应液包括：PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸扩增的引物，用于靶多核苷酸检测的探针，用于内标片段扩增的引物和用于检测内标的探针；所述用于靶多核苷酸扩增的引物包括：鲍曼不动杆菌-F和鲍曼不动杆菌-R；所述鲍曼不动杆菌上游引物Ab-F的碱基序列为：5’-GCTTCCGCTATTCCARTTTATCA-3’；所述鲍曼不动杆菌下游引物Ab-R的碱基序列为；5’-AACCAACACGCTTCACTTCMTTA-3’；所述用于靶多核苷酸检测的探针Ab-P的碱基序列为：5’-TTAGCTCGTCGTATTGGACTTGARCTCATGT-3’。2.根据权利要求1所述的一种检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒，其特征在于，所述内标为插入pMD18T载体的一段长为177碱基对的人工合成DNA序列的重组体；所述内标的177碱基对序列为：5-ATGCCATGAAAGCTTCCGCTATTCCATTTATCAAGATTTAGCTCGTCGTATTGGACTTGACTCATGTCTAAGGAAGTGAAGCGTGTTGGTTATGGCAATGCAGATATCGGTACCCAAGTCGATAATTTTTGGCTGTGGGTCCTTAAAAATTACTCCTCAGCAAGAGGCACATTTGCT-3’。3.根据权利要求2所述的一种检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒，其特征在于，所述用于内标片段扩增的引物包括：上游引物IC-F和下游引物IC-R；所述上游引物IC-F的碱基序列为：5’-CCGACGAGCCGAACCACA-3’所述下游引物IC-R的碱基序列为：5’-CACACCACGGACACACAAAGGA-3’；所述用于检测内标的探针IC-P的碱基序列为：5'-CAAGACGGATTGCGAGCCTTACAGC-3'。4.根据权利要求1-3任一项所述的一种检测鲍曼不动杆菌DNA的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液由0.2U\...

【专利技术属性】
技术研发人员：易晓明，黄河，王铁军，刘佳，邓中平，戴立忠，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43