一株诺氟沙星降解乙酸钙不动杆菌NOR‑36及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种消除废水中诺氟沙星残留的降解菌剂，属于生物高科技技术领域。所用菌株为革兰氏染色反应阴性菌NOR‑36，经鉴定为乙酸钙不动杆菌（

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物高科技
，具体涉及一株诺氟沙星降解乙酸钙不动杆菌NOR-36及其应用。
技术介绍
兽用抗生素是指以亚治疗剂量用于动物饲料中，以保障动物健康、或促进动物生长与生产、提高饲料利用率的抗生素。抗生素本身对人体是无害的，但如果过量使用将使病源细菌产生耐药性，导致抗生素对其失效。抗生素的过量使用使药物耐药性、畜产品药物残留等都成为了不可忽视的严重问题，尤其是破坏动物的免疫机能。同时抗生素属于难生物降解物质，一旦造成抗生素污染，很容易在环境中富集，诱导耐药菌株产生，对环境微生态造成严重的影响。氟喹诺酮类药物在我国畜牧水产养殖业中已广泛应用，但在使用中发现，氟喹诺酮类药物会产生一系列的不良反应，如皮肤过敏反应及光敏反应、软骨毒性、循环系统反应、中枢神经系统(CNS)反应、胃肠道反应等，直接影响了畜牧和水产养殖业的发展。诺氟沙星是当前广泛应用于临床的第三代喹诺酮抗生素(氟喹诺酮类)的代表药物之一。由于诺氟沙星的喹诺酮环的稳定性和抗水解能力使其成为持久性污染物，目前已多次在水体中被检测出来。微生物降解具有成本低、效率高、无二次污染、生态恢复性好等优点，已在很多方面得到应用，所以筛选出诺氟沙星降解菌对于处理诺氟沙星生产废水具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，利用微生物的方法来降解废水中的污染物，适用于现代废水处理工艺，使废水达标排放，同时降低生产和使用成本。本专利技术提供一种消除诺氟沙星残留的降解菌，其菌株NOR-36是一株革兰氏染色反应阴性菌，于2015年2月9日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCjfta:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)，保藏编号CGMCC N0.10540，经鉴定是乙酸1?不动杆菌difle1Aacier.calcoacetIcus^a生物学特性为革兰氏染色阴性，菌落光滑，短杆状，接触氧化酶阳性，硝酸盐还原酶阴性。本专利技术提供了甲基杆菌N0R-36在诺氟沙星降解中的应用。在实验室摇瓶培养条件下使浓度为500ug/L的诺氟沙星降解率达90%以上。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。本专利技术提供了含有所述乙酸钙不动杆菌N0R-36的菌剂。本专利技术还提供了所述乙酸钙不动杆菌N0R-36生产菌剂的方法。所述乙酸钙不动杆菌N0R-36生产菌剂的方法，包括:斜面种一摇瓶种一种子罐一生产罐一产品，所述产品的包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂。所述生产菌剂的方法，具体为: O将诺氟沙星残留的乙酸钙不动杆菌N0R-36的试管种接种于添加哌嗪的LB培养基中，振荡培养至对数期； 2)将步骤I)培养好的菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，即种子液； 3)将步骤2)所述种子液按10%的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵完成后的培养液即为菌剂； 4)步骤3)所述菌剂直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型，或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。步骤I)中所述的LB培养基配方为:NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L,哌嗪 5g/L，ρΗ7.0。步骤2)所述的种子罐所用的培养基配方为:哌嗪5g/L，葡萄糖8g/L，(NH4)2S04 Ig/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCl lg/L%，CaCO3 0.5g/L，酵母膏 2g/L，pH 值 7.2-7.5。步骤2)所述种子罐和步骤3)所述的生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30_35°C，步骤2和3的整个工艺流程培养时间为48-60小时。所述菌剂在诺氟沙星降解中的应用。本专利技术所述的乙酸钙不动杆菌N0R-36能使水体中诺氟沙星的残留量降低90%以上，降低诺氟沙星在环境中富集并影响环境微生态的风险。所制备的菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在全国的污水处理厂尤其是畜禽养殖废水处理厂大面积推广使用。本专利技术是利用微生物的方法降解化学农药，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工，对于保护生态环境，保护人类的身体健康，提高水环境质量安全具有重要的意义。使用该降解菌剂可以在降低水中化学需氧量浓度、氨氮浓度以及总磷浓度等常规污染物的同时，降低出水中诺氟沙星浓度。本专利技术对于保护生态环境，保护人类的身体健康，降低废水处理成本具有重要的意义。【附图说明】图1本专利技术所述的乙酸钙不动杆菌N0R-36的结晶紫染色照片； 图2接种量对本专利技术所述的乙酸钙不动杆菌N0R-36降解效果的影响； 图3 pH对本专利技术所述的乙酸钙不动杆菌N0R-36降解效果的影响； 图4诺氟沙星降解菌效果验证。【具体实施方式】以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1诺氟沙星降解乙酸钙不动杆菌N0R-36的筛选和分离 取从生产诺氟沙星的某农药厂生产车间的废水处理池中得到的活性污泥3.0ml加入10ml诺氟沙星浓度为50mg/L的含有哌嗪的LB培养基中，其配方为:含5g/L哌嗪，NaCl10.00g/L,蛋白胨 10.00g/L,酵母粉 5.00g/L, pH 7.0，于 160r/min，30°C条件下振荡培养，每隔7天按3%的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中，连续转接5次。取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml无菌水中，配成KT1的富集液，再吸取1.0ml配好的10—1的富集液加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10 _2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1ml涂布于含诺氟沙星的浓度为500ug/L无机盐固体培养基(配方为:每升含500ug哌嗪，1.50g K2HP04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20gMgS04X7H20、l.0Og NaCl,1.0Og (NH4)2SO4, 20.0Og 琼脂，pH 7.0)上，30°C培养7 天。7 天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于3.0ml的LB液体培养基中培养24小时后，LB液体培养基配方为:哌嗪5g/L，NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L，pH7.0于8000r/min的条件下离心2min，倒去上清液，加入3.0ml的无菌水摇勾，仍于8000r/min的条件下离心2min，按此方法用无菌水洗两遍后，加入3.0ml无菌水重悬该菌。吸取1.0ml该菌液加入10ml诺氟沙星浓度为500ug/L的哌嗪-无机盐液体培养基中(配方为:每升含500ug哌嗪，1.50g K2HP04、0.50g KH2PO4'0.20g MgSO4X 7H20、1.0Og NaCl,1.0Og (NH4)2SO4,20.0Og琼脂，pH 7.0)，于160r/min，30°C条件下振荡培养72h后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株菌株当前第1页1&nbs本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株诺氟沙星降解乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter.calcoaceticus）菌株NOR‑36，其保藏编号为CGMCC NO.10540。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡天明，陈立伟，杨倩，蔡舒，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32