【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于探针熔解技术检测BRAF基因突变的方法。
技术介绍
基因突变是指基因组DNA分子在结构功能上发生碱基组成或排列顺序的改变,主要包括碱基的替代和片段的插入缺失,是导致基因型疾病的重要原因之一。基因突变分析在生物医学研究中,尤其是在基因型疾病诊断及病理研究中有着非常重要的作用。BRAF基因编码的蛋白参与由表皮生长因子受体(EGFR)介导的细胞信号转导通路,影响细胞的增殖、生长和转移;正常的BRAF基因编码的蛋白在接受上游信号活化后被激活,并将在信号传递给下游细胞因子后恢复非激活状态;而某些位点(主要在第600位密码子)突变的BRAF基因所编码的蛋白无需上游信号活化便始终处于激活状态,导致细胞的非正常增殖和生长,引起恶性肿瘤。抗EGFR类肿瘤药物通过特异性阻滞EGFR与受体结合,阻断细胞转导通路,从而达到抑制癌细胞增殖的目的;多项研究发现,接受抗EGFR药物治疗的结直肠癌或肺癌患者中,BRAF基因野生型的患者较BRAF基因突变型患者更能从治疗中受益:BRAF基因野生型的患者具有更高的药物客观反应率和较长的生存时间。因此,能够准确检测BRAF突变状态对指导结直肠癌或肺癌患者临床用药有重要意义。传统检测BRAF基因突变的方法多种多样,其中最为经典是双脱氧测序技术(Sanger sequencing),此外还包括连接酶检测反应(LDR)、多聚酶链限制性长度多态性分析(PCR-RFLP)和TaqMan技术。这些方法能够检测突变是否存在,但大多数方法不能确定突变的类型并且只能检测到突变的一部分;同时大多数方法需要琼脂糖凝胶电泳等PCR后处理检测才能 ...
【技术保护点】
一种基于探针熔解技术准确检测BRAF基因突变的方法,包括以下步骤:(1)分子信标探针和模板扩增引物的设计及合成上游引物(27nt):5’‑TGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAG‑3’延伸阻滞引物(43nt):分子信标探针(35nt):(2)提取被测样本的基因组DNA;(3)配制反应体系在反应管中加入被测样本的基因组DNA、上游引物、延伸阻滞引物、UNG酶(尿嘧啶‑N‑糖基化酶)、5’→3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUMTM Taq DNA Polymerase)或同类型酶,dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脱氧尿苷三磷酸)、分子信标探针、10×PCR Buffer(TIANNIUMTM Taq PCR Buffer)或同类型Buffer;(4)PCR反应将配制好的反应体系在荧光实时定量PCR仪上进行扩增和熔解,PCR反应完成后进行熔解曲线分析,通过熔解峰的Tm值判断出被测样本中是否发生了BRAF突变。FDA00002770034000011.jpg,FDA00002770034000012.jpg
【技术特征摘要】
1.一种基于探针熔解技术准确检测BRAF基因突变的方法,包括以下步骤: (O分子信标探针和模板扩增引物的设计及合成 上游引物(27nt):5,-TGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAG-3, 延伸阻滞引物(43nt):2.根据权利要求1所述的基于探针熔解技术准确检测BRAF基因突变的方法,其特征在于: 以单管反应体系25 μ I计,反应管中加入上游引物600ηΜ,延伸阻滞引物60nM,UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0.2U,5’ 一3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM Taq DNAPolymerase)或同类型酶0.5U,dNTPs (脱氧核糖核苷三磷酸)20...
【专利技术属性】
技术研发人员:戴鹏高,陈超,刘金辉,焦维丽,邹晖,
申请(专利权)人:陕西北美基因股份有限公司,
类型:发明
国别省市:陕西;61
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